艾烟对快速老化模型小鼠脑内氨基酸类神经递质含量效果观察.docVIP

艾烟对快速老化模型小鼠脑内氨基酸类神经递质含量效果观察 　　艾灸疗法是中医学主要疗法之一，应用范围十分广泛。保健强壮、养生延年是艾灸的主要作用之一。研究表明艾灸可通过提高免疫、调整内分泌、改善代谢等途径达到抗衰老的效应[1-3]。艾灸作用除温热刺激、光、辐射等物理效应外，还存在艾燃烧生成物（即艾烟）的药用化学作用[4]。目前对于艾灸机制研究多数集中于温热效应，对艾烟的效应研究尚不充分。 　本实验选用快速老化模型小鼠（SAMP8）作为干预对象，通过观察艾烟对SAMP8脑内氨基酸类神经递质含量的影响，探讨艾烟抗衰老的作用效应，以期为艾灸疗法的作用机理研究提供参考。同时，实验采用2times;3析因设计，比较不同浓度及不同时间的艾烟干预下SAMP8脑内氨基酸类神经递质含量，探讨艾烟干预的适宜参数。 　1 实验材料 　1.1 动物 　本实验选用清洁级6月龄雄性SAM小鼠80只，购自天津中医药大学第一附属医院动物中心，许可证号：SCXK（津） 2008-0001。其中SAMP8 70只，同品系正常老化小鼠（SAMR1）10只，体质量（30plusmn;2.7）g。所有小鼠均采用标准动物饲料喂养，自由进水；饲养环境温度为（22plusmn;2）℃，湿度保持在50%～60%。采用人工控制室内照明，保持12 h光照（8：00～20：00）和黑暗（20：00～次日8：00）交替循环。 毕业论文 　1.2 主要仪器与试剂 　特制细艾条（phi;0.5 cmtimes;20 cm，河南南阳汉医艾绒有限公司）；小鼠固定笼（自制，圆柱形，底面直径5 cm，高10 cm）；带孔玻璃缸（自制，80 cmtimes;80 cmtimes;60 cm，顶层玻璃正中设有直径为5 mm的圆孔；光散射式数字粉尘测试仪（北京宾达绿创科技有限公司）。谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、gamma;-氨基丁酸（GABA）标准品，均由国药集团化学试剂有限公司生产。 　2 实验方法 　2.1 分组 　小鼠适应性饲养1周后，10只SAMR1为正常组，70只SAMP8按随机数字表法分为模型组和6个艾烟干预组。采用2times;3析因设计，艾烟干预浓度分别为低浓度（5～15 mg/m3）、中浓度（25～35 mg/m3）和高浓度（85～95 mg/m3），干预时间为15 min和30 min两个水平。6个艾烟干预组分别为低浓度15 min组、低浓度30 min组、中浓度15 min组、中浓度30 min组、高浓度15 min组、高浓度30 min组。 　2.2 艾烟干预 　将艾烟干预各组小鼠每日暴露于艾烟中，共4周。空白干预：空白干预包括正常组与模型组小鼠。分别用自制小鼠固定笼固定后放入玻璃缸内，不做其他处理，30 min后取出。①低浓度干预：将调试好的粉尘测试仪置于玻璃缸中间，将小鼠用自制小鼠固定笼固定后放于玻璃缸内。点燃细艾条，从玻璃缸上方圆孔中将燃烧的一端插入，令艾烟充满玻璃缸。用粉尘测试仪测试其浓度达到预定范围后（此过程艾条燃烧约15 s），将艾条取出，迅速封闭圆孔。此后每隔3 min记录1次浓度数值，使数值保持在10 mg/m3左右。若数值高于15 mg/m3，可将上方玻璃盖稍微移动，令艾烟散去部分后迅速将盖子移回；若数值低于5 mg/m3，可再将点燃的艾条由圆孔插入，以补充艾烟。②中浓度干预：艾条在玻璃缸内的燃烧时间延长至32 s，以使浓度数值保持在30 mg/m3左右。方法同低浓度组。③高浓度干预：艾条在玻璃缸内的燃烧时间延长至82 s，并使浓度数值保持在90 mg/m3左右。方法同低浓度组。 　每次艾烟干预结束后，打开玻璃缸释放艾烟，并擦拭玻璃缸清除艾燃烧残留物，以便下次实验操作。 　2.3 取材 　在干预4周后，所有小鼠处死后，冰台上快速取脑。将取得的脑组织放入标记的冻存管中，液氮冻存数分钟后移入-70 ℃冰箱待检。 　2.4 指标检测 　邻苯二甲酚（OPA）柱前衍生反相高效液相色谱法检测脑组织Glu、Asp、GABA的含量。采用岛津LC-10ATVP系列高效液相色谱仪，配LC-10ATVP高压泵和自动进样器，RF-10AXL荧光检测器和岛津色谱工作站。流动相A：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液-甲醇[65∶35（V/V）]；流动相B：0.01 mol/L磷酸盐缓冲液-甲醇[10∶90（V/V）]。梯度洗脱顺序：0～13.50 min，0%～30%B；13.51～20.00 min，80%B；20.01～30.00 min，0%B。流速：1 mL/min；进样量：20 nL。荧光检测器波长：激发波长（Ex）=357 ran；发射波长（Em）=455 nm。 　3 统计学方法 　采用SAS8.2统计软件进行分析。数据以”x