芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF—1α、VEGF表达方式分析.docVIP

芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF—1α、VEGF表达方式分析 　　[关键词] 川芎嗪；视网膜新生血管；血管内皮生长因子；缺氧诱导因子 　[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）11（b）-0005-02 　笔者在缺氧时的牛眼视网膜血管内皮细胞（BREC）培养上清液中加入不同浓度的川芎嗪，研究其对HIF-1alpha;表达的影响，及对体外培养的血管内皮细胞增殖的作用，探讨川芎嗪的作用机制。 　1 材料与方法 　1.1 实验试剂 　盐酸川芎嗪注射液，由无锡市第七制药有限公司生产，规格为40 mg/2 mL，批号010913。药物用培养基稀释至所需浓度。F12 培养基（Gibco，美国）；兔抗HIF-1alpha;多克隆抗体（武汉博士德）；胎牛血清（Gibco，美国）；EBM-2 Basal Meidum（北京毕特博）。免疫组化采用北京中山公司免疫组化试剂盒（二步法）。其他试剂皆为分析纯。 　1.2 BREC细胞的培养 　取死后3 h内健康牛眼（取自潍坊肉联厂），70%酒精浸泡，角膜缘后4 mm剪开，剥出视网膜神经层，剪碎、匀浆，孔径80 mu;m金属筛网过滤，洗脱液离心（1 000 r/min，7 min），0.02%胶原酶Ⅰ消化（37℃，1～2 h），离心洗涤并收集细胞，接种于鼠尾胶原培养皿内，20%胎牛血清的M199和EBM-2混合培养液，放入37℃ 5%CO2培养箱培养。培养液次日更换继续培养。以后每3天换液1次。长至近融合状态时，用0.1%胰蛋白酶消化、传代细胞。血管内皮细胞鉴定采用第Ⅷ因子相关抗原检测法，纯度为90%以上[1]。 　1.3 细胞处理及分组 　将对数生长期的BREC细胞分别以浓度1.5times;105/mL细胞悬液接种于24 孔培养板，置于37℃ 5%CO2培养箱内培养24 h，细胞分为以下3组：F12培养基常规培养组（正常对照），模拟缺氧组（加入终浓度125 mu;mmol/L的CoCl2）和药物治疗组（加入含不同浓度川芎嗪20、40、120 mu;g/mL），各组分别培养24 h，每项指标每组各测6个培养孔，分别取平均值。 　1.4 培养上清液VEGF含量ELISA法测定 　按照说明书步骤严格进行操作，在酶标仪波长492 nm比色定量。所有标本均作双管检查，对VEGF含量在标准曲线最高值以外的标本稀释10～100倍后重新测定。 　1.5 PCNA免疫组化 　-10℃甲醇固定培养细胞5 min，用3%H2O2孵育5 min后冲洗，加入1∶100稀释的一抗于4℃过夜，洗后滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育20 min，PBS洗后以DAB显色。阴性对照以PBS 液代替一抗。结果以胞核内有棕黄色颗粒为阳性判定标准，高倍镜下（times;400）随机选择每张切片5个视野，采用计算机图像分析系统进行灰度分析。 　1.6 细胞内ATP含量测定 　培养孔中加入煮沸的PBS 3 mL，振荡后立即吸入试管中，沸水浴10 min后冰水冷却，低温离心13 000 r/min 15 min，将上清液试管置于冰水中待测。反应杯中加入样品0.2 mL，放入荧光光度计反应暗室，微量进样器向反应杯中注入荧光素-荧光素酶液0.8 mL，测定相对发光强度。按绘制好的ATP标准曲线计算出ATP含量。 　1.7 HIF-1alpha;免疫荧光染色 　-10℃甲醇固定培养细胞5 min，冲洗后，0.3%H2O2吐温30 min，PBS洗3 次，1∶100稀释的RABBIT Anti-HIF-1alpha;细胞于4℃过夜，洗后滴加FITC标记山羊抗兔IgG抗体，37℃孵育60 min，PBS冲洗细胞后于荧光显微镜下观察。阴性对照以PBS液代替一抗。结果判定以细胞核或胞浆呈绿色荧光为阳性标准，每张切片随机选择5个视野在高倍镜下（times;400）采用计算机图像分析系统进行荧光分析。 　1.8 数据处理 　应用SPSS 10.0统计分析软件包进行。数据均以均数plusmn;标准差（xplusmn;s）表示，组间比较用t检验。P lt; 0.05表示差异有统计学意义。 　2 结果 　2.1 血管内皮细胞培养上清液VEGF的检测 　表1显示，缺氧时BREC细胞培养上清液中VEGF浓度增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的VEGF增加，且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20 mu;g/mL时，其培养上清液VEGF水平已显著下降（P lt; 0.05）。见表1。 　2.2 血管内皮细胞PCNA、HIF-1alpha;的表达及ATP含量 　表1显示，缺氧时BREC细胞中PCNA、HIF-1alpha;表达及ATP含量均增加，而不同浓度的川芎嗪可减少缺氧引起的PCNA、HIF-1al