草木犀石油醚提取物对NFκB及血红素氧合酶1表达影响.docVIP

草木犀石油醚提取物对NFκB及血红素氧合酶1表达影响 　 作者：庞然, 张淑玲, 赵雷, 刘双林, 董继华, 陶君彦 【摘要】 目的: 探讨草木犀的石油醚提取物在炎症中的作用。方法: 通过LPS干预RAW264.7 细胞系建立炎症细胞模型, 免疫细胞化学法检验NFκB的表达及分布变化, 实时荧光定量RTPCR法检测血红素氧合酶1（HO1）的基因表达, Western blot法测定HO1的蛋白表达量。结果: 免疫细胞化学法结果显示药物干预时胞质被染为棕色, NFκB多分布在胞质未被激活; 仅有LPS干预时, 胞核被染为棕色, NFκB集中分布在细胞核表达增强。药物提取物干预后HO1的mRNA表达水平明显升高, 且呈剂量依赖型关系; Western blot结果显示药物干预后HO1的蛋白表达水平也明显升高。结论: 草木犀的石油醚提取物通过抑制NFκB的激活, 同时促进HO1的释放而发挥一定的抗炎作用。 【关键词】 草木犀; 石油醚; RAW 264.7细胞系; NFκB; 血红素氧合酶1 草木犀, 豆科(Leguminosae)草木犀属(Melilotus) 1年生或2年生草本植物, 是临床用于抗炎的一种中草药。然而, 草木犀产生抗炎作用的分子生物学机制还不明确。本实验中拟通过LPS刺激 RAW 264.7小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型［1］, 并采用免疫细胞化学法、 实时荧光定量RTPCR法﹑Western blot法对草木犀提取物在炎症中的作用进行的研究。 1 材料和方法 1.1 材料 RPMI1640、 TRIzol 购自Gibico公司; LPS(Escherichia coli O111: B4)和MTT购自Sigma公司; HO1羊抗鼠多克隆抗体购自Ramp;D Systems公司; 兔抗鼠多克隆抗体NFκB p65 IgG抗体购自Santa Cruz公司; MMLV逆转录酶、 dNTP购自Promega公司; SYBR Green 购自Biotium公司; Oligo(dT18)及引物由Invitrogen公司合成。草木犀于2006年8月在陕西陇县采集, 经陈科力教授（湖北中医学院）鉴定后保存于湖北中医学院药学部的植物样本库中。小鼠巨噬细胞系RAW 264.7 购自中国典型培养物保藏中心。 1.2 方法 1.2.1 草木犀石油醚提取物的制备 取50 g风干的草木犀磨成粉末, 用700 mL/L乙醇于85℃提取3次(1次500 mL, 每次 1.5 h), 真空过滤浓缩提取液, 用去离子水稀释至1 g/mL（药材∶水）浓度。取5 mL浓缩液至100 mL的分液漏斗中, 连续石油醚提取直至其干重达0.425 g。用RPMI1640培养液将其稀释成3种浓度10 mg/L、 5 mg/L和1 mg/L备用。 1.2.2 细胞培养 小鼠巨噬细胞系RAW264.7使用RPMI1640培养液（加入100 U/mL青霉素, 100 mg/L链霉素和100 mL/L胎牛血清）, 50 mL/L CO2培养箱中37℃培养。 1.2.3 细胞模型的建立和干涉 LPS处理前24 h将细胞接种于6、 24或96孔板上, 24 h后细胞贴壁后弃上清, 加入含LPS10 g/L的培养液和不同浓度的提取物, 作用不同时间后收集细胞, 分别使用免疫细胞化学法, 实时荧光定量RTPCR法, Western blot法检测。 1.2.4 实验分组 实验共分4组。(1)阳性对照组: 地塞米松(DM) 0.5 g/L作阳性对照; (2)阴性对照组: 黄芪多糖(APS)100 mg/L作为阴性对照; (3)空白对照组: 只用10 g/L的LPS处理而不加药物干预; (4)正常对照组: 不用LPS处理也不加药物干预。 1.2.5 药物细胞毒性的检测 用MTT法, 在终止细胞培养前4 h加入20 μL MTT溶液（浓度5 g/L, pH7.4）, 终止细胞培养后每孔加入150 μL DMSO, Spectramax 250全自动定量绘图酶标仪测定A490值。细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）检测, 细胞在提取液中培养24 h后在显微镜下观察细胞形态以检测细胞病变。 1.2.6 NFκB的检测 利用免疫细胞化学法(SP)检测NFκB的表达及分布变化。将盖玻片置于培养板中, 并将细胞接种于培养板, 待细胞爬片后, 药物干预细胞2 h。PBS洗涤, 4℃丙酮固定10 min; 30 mL/L过氧化氢甲醇溶液孵育20 min以封闭内源性过氧化物酶; 10 mL/L Triton X100 37℃ 5 min, P