采用基因打靶技术构建结核分枝杆菌新基因Rv0901缺失株的研究3.PDFVIP

中国病理生理杂志 　Chinese Journal of Pathophysiology 　2004 ,20 (8) :1507 - 1510 ·1507 · ( ) [文章编号] 　1000 - 4718 2004 08 - 1507 - 04 采用基因打靶技术构建结核分枝杆菌新基因 Rv0901 缺失株的研究 △ 邱云青 , 　鲍 　朗 , 　赵计林 , 　赵明才 , 　张会东 , 　吴悦涵 ( 四川大学华西医学中心感染免疫研究室 , 四川 成都 610041) 　　[摘 　要] 　目的:利用基因打靶技术构建基因打靶载体和基因缺失株 ,用于结核分枝杆菌基因 Rv0901 功能的 研究 。方法 :结核分枝杆菌标准株 H37Rv 体外培养 ,对其 Rv0901 基因及两侧序列进行体外扩增 ,连接载体及 目的 片段 ,切除目的基因 ,再引入筛选标志构建重组自杀质粒 ,分别用酶切及 PCR 鉴定 ;用电穿孔法将重组 自杀质粒转 入结核杆菌 H37Rv 株 , 用 PCR 鉴定 。结果 : 经鉴定 PCR 产物及插入片段大小与预期值相符 ,且为所需目的基因片 段 ,成功切除靶片段 ;蓝白斑筛选证实标记基因插入片段插入方向正确 ;Rv0901 基因缺失株用 PCR 鉴定成功缺失了 目的基因片段 25 kb 。结论 : 成功构建了用于结核分枝杆菌基因打靶的置换型载体和 Rv0901 新基因缺失株 ,为 Rv0901 基因功能的研究奠定了基础 。 [ 关键词] 　基因敲除 ; 基因 ,Rv0901 ; 分枝杆菌 ,结核 　　[ KEY WORDS] 　Gene knockout ; Genes , Rv0901 ; Mycobacterium tuberculosis 　　[ 中图分类号] 　R363 　　　[文献标识码] 　A 　　结核杆菌是引起人类结核病的病原菌 ,近年由于结核杆 晶美生物工程有限公司和基因有限公司 ,DNA T4 连接酶和凝 菌多重耐药菌株及人免疫缺陷病毒 HIV 感染者增多 ,使结核 胶纯化试剂盒购 自晶美公司 。 病发病率和死亡率呈上升趋势[ 1] 。尽管 1998 年结核杆菌 表 1 　本研究所用的菌株和质粒 H37Rv 的全基因组测序已完成 ,但其基因组中大量未知基因 Tab 1 　The strains and plasmids of this study ( ) 包括毒力相关基因的功能未被阐明。基因敲除 基因打靶 Bacterial strains Origin and 技术为结核杆菌毒力基因功能的研究、耐药性产生机理 、抗 Relevant genetype and/ or phenotype and plasmids reference 结核杆菌药物筛选及疫苗候选分子的选择等提供了一个有