广州管圆线虫LDH基因的克隆、表达及免疫诊断价值初步的分析研究.pdf

广州管圆线虫LDH基因的克隆、表达及免疫诊断价值初步研究 中文摘要 广州管圆线虫LDH基因的克隆、表达 及功能初步研究 专业： 病原生物学 硕士生： 程梅 导师： 詹希美教授 摘 要 广州管圆线虫病是一种人兽共患寄生虫病，亦称为嗜酸性粒细胞增多性脑炎 or or EME)，此病 和脑膜脑炎(eosinophilicmeningitismeningoencephalitis，EM cantonensis，AC)寄生于人体中枢神经系统 是由广州管圆线虫(Angiostrongylus 而引起。该病在太平洋沿岸及太平洋岛屿国家和地区有暴发或散发流行，对人类 危害较大，我国最早在台湾发现了首个病例，近年来我国大陆广东、浙江、上海、 辽宁、福建、天津等地出现多例广州管圆线虫病的疑似病例或确诊病例，在浙江 和福建两省发生多次暴发流行，这些己引起了广大寄生虫学工作者和卫生部门的 重视。 随着广州管圆线虫中间宿主的不断扩散蔓延，以及人们饮食习惯的改变，该 病作为食源性寄生虫病越来越危害到人民的健康，引起了我国卫生部门和世界卫 生组织对该病的高度重视。卫生部在2003年将广州管圆线虫病列为我国“新发传 染病”，在新出现的全球性威胁的传染病中有三种属寄生虫病，广州管圆线虫病 就是其中的一种。但是到目前为止，该病尚缺乏有效的早期诊断、早期治疗和预 防措施，而对广州管圆线虫基因组的研究才刚刚起步，对功能蛋白的研究更寥寥 无几，这限制了新型诊断抗原和防治药物的研发。利用分子生物学方法寻找有诊 断价值和药物靶标价值的蛋白是消灭广州管圆线虫病的重要切入点之一。 乳酸脱氢酶(LDH)是广泛存在于动物、植物及微生物细胞内的一种重要的 广州管圆线虫LDH基因的克隆，表达及免疫诊断价值初步研究 中文摘要 同工酶，是糖酵解途径的末端酶，利用NADH为辅酶，催化丙酮酸和乳酸之间的氧 化和还原反应。LDH的同工酶在组织分布，动力学特征，理化性质及免疫学特性 等方面均有很大不同。在人体，LDH已成为一种常用的临床医用诊断用酶。已知 绝大多数体内寄生虫能量代谢的主要途径是无氧糖酵解，因此研究寄生虫LDH与 宿主LDH在分子结构及功能上的差异对于寄生虫的能量代谢、寄生虫病的免疫诊 断、疫苗研究和新抗虫药物的研发都有着重要的意义。 研究目的： 解析广州管圆线虫LDH基因的结构及其特点，构建LDH基因的原核表达系统， 优化表达条件，鉴定重组LDH基因的免疫反应性，以期获得能用于广州管圆线虫 病诊断的基因工程重组抗原。 研究方法： 从广州管圆线虫幼虫eDNA文库随机测序得到的全长Unigene中识别出编码 LDH的基因，用生物信息学方法对其进行结构预测及同源性比较，用PCR方法 从幼虫eDNA文库中扩增出该基因，测序，定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)， 在大肠杆菌BL21中表达，优化表达条件，得到高效表达的工程菌 Purification Kit说明书纯化重组蛋 pET-30a(+)-LDH，按照Ni—IDAHis·Bind 白，用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)分析。用广州管圆 线虫病人血清及广州管圆线虫感染的不同时期小鼠血清进行免疫印迹鉴定纯化 蛋白的免疫反应性，并进行ELISA分析。 研究结果： 1． 广州管圆线虫LDH基因全长1008bp，编码335个氨基酸，氨基酸序列的理 62％，与华支睾吸虫LDH、日本血吸虫LDH的同源性分别为52％和55％，与 刚地弓形虫LDH及恶性疟原虫LDH的同源性分别为25％和24％。LDH氨基酸