免疫沉淀immuno-precipitationip.doc

免疫沉淀 (Immunoprecipitation, IP) 实验目的 富集或者纯化目的蛋白。 实验原理 利用免疫反应中抗体与抗原特异性结合的原理，将目的蛋白的特异性抗体与细胞裂解液共同孵育，然后利用固相化的protein A或者Protein G与抗体的结合，沉淀目的蛋白。 实验过程 裂解 1.1 细胞裂解 A．非变性条件 ①收集细胞1(107（100mm dish），用预冷的PBS洗两次后收集于1.5ml ep管中。 ②加入预冷的裂解液1ml（1∶100分别加入cocktail和PMSF），Tip头吹打混匀。 ③4℃旋转孵育30min。 ④离心，12000 rpm，10 min，收集上清于1.5ml ep管中。 B．变性条件 ①0.5-2(107细胞中加入100(l变性裂解液。 ②Vortex几秒混悬，95℃变性5min。 ③超声打断DNA，悬液变澄清，离心，12000 rpm，4℃，10 min，收集上清。 ④以900(l非变性裂解液稀释，用以免疫沉淀。 组织裂解 在液氮中砸碎组织块（具体细节见乐飞“细胞/冰冻组织/血液总RNA的提取”），加裂解液至最佳浓度1-5mg/ml，4℃旋转孵育2小时。 离心，12000 rpm，4℃，10 min，收集上清。 预孵育 预孵育可以减少与agrose或sepharose beads非特异结合的蛋白。无关抗体或血清的预孵育也可以除去除去与免疫球蛋白非特意结合的蛋白。如果免疫沉淀的最终产物将被用以免疫印迹，那么预孵育的步骤可以省略。 ①加入100(l beads悬液，4℃旋转孵育30min。 ②1500 (g，4℃，1min，收集上清，并吸出50(l作为Input。离心条件可根据beads说明书适当调整。 免疫沉淀 ①在预孵育后的细胞上清中加入目的蛋白特异的抗体，4℃旋转孵育1小时以上甚至过夜。抗体的用量和孵育时间随目的蛋白的丰度和抗体对目的蛋白的亲和性改变，一般抗体datasheet上都有IP推荐用量。并非所有抗体都适用于IP实验。 ②抗体孵育完成后，在每一样品管中加入70-100 beads悬液，4℃旋转孵育4小时。Beads的选择见附录。Beads贮存液中含有的物质可能影响IP结果，因此使用前都需经过wash，一般以1ml细胞裂解液或PBS洗两次，悬浮后平均分配到各样品管中。吸取beads的Tip头应剪去约5mm尖端，以免对beads造成损伤。 ③孵育完成后，1500 (g，4℃，1min，离心收集已结合了抗体和目的蛋白的beads。 ④wash。将1ml裂解液加入样品管，4℃旋转3-5min，离心收集beads。重复两次。Wash的目的主要是为了出去残留液体的污染，通过改变wash buffer中的盐离子浓度，也可以减少非特异结合。 ⑤最后，如果要以SDS分析IP产物，以25-50(l 1(SDS对beads沉淀及Input进行裂解。 实验注意事项 裂解液中必须加蛋白酶抑制剂cocktail和PMSF，且即加即用。 IP条件根据情况不同而改变，这些不同的情况包括目的蛋白的定位，实验结果拟采用的分析方法和用途等。 将抗体与beads交联可以大幅增加IP效率，如Flag，HA等已有商品化的交联beads。 实验相关试剂的配制 1. 非变性裂解液 20 mM Tris HCl pH 8 137 mM NaCl 10% glycerol 1% Nonidet P-40 (NP-40) 2 mM EDTA 4℃可贮存6个月 2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer 因含有脱氧胆酸钠和SDS，RIPA裂解液具有较强的裂解能力，适用于裂解核膜。能使激酶失活。 50mM Tris HCl pH 8 150 mM NaCl 1% NP-40 0.5% sodium deoxycholate 0.1% SDS 3. 变性裂解液 适用于只能识别变性状态下的抗原表位的抗体。也可用于无盐条件下提取抗原。 1% SDS 5 mM EDTA 室温贮存一星期 免疫共沉淀 (Co-Immunoprecipitation, Co-IP) 实验目的 鉴定或寻找目的蛋白的相互作用蛋白。 实验原理 当细胞在非变性条件裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间结合被保留下来。因此，利用免疫沉淀的方法纯化目的蛋白的同时，也可以将与其在生理条件下相互作用的蛋白共同沉淀下来。 实验过程 见非变性条件下的IP过程。 实验注意事项 1. 用相关的对照抗体进行平行的免疫沉淀很重要。 比起IP仅针对目的蛋白，Co-IP特别是内源性的Co-IP是体内蛋白复合物的纯化，因此所需要的细胞数或者最终的上样量都要视情况增加。 在Co-IP过程中，尽量避免超声，因其趋向于变性和破坏蛋白之间