WT1基因异构体对白血病细胞生物学行为影响的分析研究.pdfVIP

wTl基因异构体对白血病细胞生物学行为影响的研究 中文提要 中文提要 目的：优化悬浮培养的白血病细胞电穿孔转染的条件。将携带wTl基因四种 异构体全长eDNA的真核表达载体转导白血病细胞株NB一，建立稳定表达的单克 隆细胞株。探讨wTl基因及其异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4增殖、 分化、凋亡等生物学行为的影响及其分子机制。 方法：通过调整电压、电容、细胞状态、温度及缓冲液等不同转染条件，以 绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，用流式细胞仪和荧光显微镜观察转染效率，优 化悬浮培养白血病细胞的电穿孔转染条件。用电穿孔的方法分别将对照质粒 病细胞株NB。，建立稳定表达外源基因的细胞株并用有限稀释法进行单克隆化。 采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成试验及细胞周期动力学检 测，了解表达外源性wTl基因异构体WTA从而将wTl基因异构体表达的比例由 学观察，NBT还原试验，细胞表面分化抗原CDllb的检测了解外源性表达WTl 基因异构体WTA对NB4细胞分化的影响。用DNA凝胶电泳，流式细胞仪测定 AnnexinV结合力等方法观察、ⅣT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB。 诱导凋亡的作用。用RT-PCR方法检测WTl基因异构体WTA转导NB一细胞后， NB4细胞PML／RAR 相关基因表达的改变。运用eDNA微阵列技术检测wTl基因异构体表达比例的转 表达的改变。 结果：①低电压、高电容能高效转染悬浮培养的人白血病细胞，细胞类型不 同条件有所差异，NB4细胞在350V、950uF得到最大转染率32．9％(转染48小时后)。 ②wTl基因异构体能够通过电穿孔方法成功转染白血病细胞株NB。，外源基因在 NB4细胞中稳定整合及表达，并能通过有限稀释法将永久表达细胞株单克隆化。③ 用台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线，提示转染WTl基因异构体的细胞NB,dWTA生 缓，在第3天达平台期(78 显示，NB4／WTA细胞在各个时间段的A值均低于对照组，统计学处理有显著性差异， WTI基因异构体对白血病细胞生物学行为影响的研究 r；『l文提要 Po 005。甲基纤维素集落形成试验中NBdWTA克隆形成率明显下降，集落形成 2uM)作用后集落形成抑制更加 抑制率为46．9％。在三氧化二砷As203(终浓度0 明显。细胞周期动力学检测提示，NB4／WTA组S期细胞比例升高。④细胞受全反式 5u 维甲酸ATRA(终浓度0M)诱导细胞分化48JJ,时，细胞形态检测提示，NB删TA 细胞出现部分分化，而对照组细胞分化更为明显。流式细胞仪检测NB,rWTA细胞 63±1．63)低于对照组(8 CDllb相对荧光强度(4 15±1．84)，被ATRA(终浓度 o．5u 36) 较对照组下降，当采用ATRA(终浓度0．59M)处理细胞1—3天后，两组细胞之间的 81410 较对照组明显降低，分别为0 132年111．439±0215，有显著性差异(P0．02)。 8u 经Asz03(终浓度0 细胞升高，出现更为典型的凋亡形态学改变，DNA凝胶电泳可见更明显的DNA梯 形带。⑥RT-PCR检查提示，NB4／WTA细胞PML／RAR Bcl—XL基因表达无明显改变。⑦通过表达谱芯片筛选，发现转导wTl基因异构体 WTA后，NB4细胞中共89条与细胞周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以 及细胞信号和传递蛋白等基因表达出现变化。RT-PCR验证了与细胞周期相关的 CyclinAl基因表达上调，CDK7基因表达下调。 结论：①wTl基因异构体能够通过电穿孔的方法成功转染悬浮培养的白血病 细胞NB。，并建立单克隆化的永久表达细胞株。②增加外源性wTl基因异构体 ．17AA／一KTS优势型能抑制白血病细胞株NB。的增殖，使其克隆形成能力明显下降。 的凋亡更为敏感。这些