N-氨甲酰水解酶的分离纯化及固定化的初步分析研究.pdfVIP

摘要 f D一氨基酸广泛应用于医药等领域，它是合成抗菌和抗病毒药物、人工甜味 剂、杀虫剂以及拟除虫菊酯的重要中间体，特别是作为半合成抗生素的侧链原料， D一氨基酸，更受到学术界与产业界的关注。众所周知，随着致病菌耐药性的增强， 抗生素的剂量不断提高，从而对人类导致一些意想不到的副作用。改造B．内酰胺 类抗生素(如青霉素或头孢霉素)的侧链，不同侧链改交了细菌的耐药性，而其母 核仍保持抗菌活性，这可能是克服抗生素使用剂量不断增大的一条有效途径。利 用海因酶法生产D一氨基酸理论上可以达到100％的纯度。 具有严格的立体特异选择性水解N．氨甲酰基氨基酸生成具有光学活性的氨基 酸，是海因酶法生产光学活性氨基酸的关键酶，其活性高低直接影响光学纯氨基 酸的产率及转化效率。k一一／ ／ 本论文对Ⅳ．氨甲酰基一D．氨基酸酰胺水解酶进行了初步研究，主要包括以下 几个方面：1)N-氨甲酰基-D．氨基酸酰胺水解酶进行了分离纯化；2)对其性质 进行了研究：3)对Ⅳ．氨甲酰基．D。氨基酸酰胺水解酶固定化的条件进行了优化 并对固定化酶的性质进行了初步探讨。 Ⅳ—氨甲酰氨基酸酰胺水解酶(NCase)被纯化了15．74倍，收率为O．75％， 纯化的收率和倍数较低，这可能因为Burkholderia Njut01中的NCase的 cepecia 含量不是很高，并且NCase容易氧化失活，造成较低的收率。SDS／PAGE该酶的 KDa。 亚基分子量是35 酶学性质研究表明，(1)BurkholderiaN-氨甲酰-D～氢基酸酰胺 Njutol cepecia 水解酶是严格的D．．v一氨甲酰氨基酸酰胺水解酶，其初速度受底物浓度的影响， 高浓度底物抑制NCase的酶活。(2)钡JJ定了基本动力学常数：当N—phe为底物时 的底物浓度约1．2 N-氨甲酰一D一氨 Njut01 mg．mL～。(3)Burkholderiacepecia 基酸酰胺水解酶的最适pH为7．2，最适温度为52℃。(4)Burkholderia cepecia Niut01N-氨甲酰一D一氨基酸酰胺水解酶在空气中极易失活，解决NCase的失活问 题将对利用NCase进行D一氨基酸生产有重要意义。(5)研究了金属离子对NCase Ba2+对酶有激活作用，重金属cu2+、H92+对酶有强烈的抑制作用。过渡金属中除 剂对Burkholderia Njut01中的Ⅳ-氨甲酰一D一氨基酸酰胺水解酶的研究可 cepeeia 知，当加入不同浓度的修饰试剂时，酶活都有一定程度的抑制，因此，在催化过 程中，该酶的巯基是必需的。 ， ／对Ⅳ一氨甲酰水解酶的固定化条件进行了优化。使用不同的方法(碳二亚胺 ＼ 法和环氧基载体法)固定化Burkholderia 达到21．4％的收率。结果表明，固定化在4℃下进行20小时，蛋白浓度应确定为 L。研究了固 2mg．mL-1，对于氨化后的载体与酶固定化时的EDC的量应为500u 定化的Ⅳ-氨甲酰水解酶的基本性质，环氧基载体固定化酶和氨基载体固定化酶最 适温度为60。C～65C，最适pH8．5～9．0。固定化酶储存半衰期为六个月左右，转 、 化的批次大约为10批。1一 关键词：Ⅳ_氨甲酰氨基酸酰胺水解酶分离纯化性质固定化 II ABST