转染抑癌基因PTEN对人乳腺癌ZR751细胞细胞周期及增殖能力影.docVIP

转染抑癌基因PTEN对人乳腺癌ZR751细胞细胞周期及增殖能力影 　抑癌基因也称为抗癌基因。正常细胞中存在基因，在被激活情况下它们具有抑制细胞增殖作用，但在一定情况下被抑制或丢失后可减弱甚至消除抑癌作用的基因。下面是小编搜集整理的相关内容的论文，欢迎大家阅读参考。　　【摘要】目的：观察PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因)对人乳腺癌细胞ZR751细胞增殖和细胞周期的影响。方法：利用脂质体介导法将携带有野生型和突变型PTEN cDNA的真核表达载体pBPwtPTEN和pBPG129RPTEN导入人乳腺癌ZR751细胞(质粒转染成功后实验分为CWTPTEN组、CG129RPTEN组和未转染质粒组即对照组)后，以RTPCR、Western blot 分析目的基因的表达，并采用MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期。 结果：CWTPTEN组、CG129RPTEN组细胞PTEN mRNA 及PTEN蛋白出现明显的高表达。CWTPTEN组细胞生长的抑制率可高达42.7%，与对照组比较，差异有显著性(Plt;0.05)。但CG129RPTEN组细胞生长的抑制率与对照组比较，差异无显著性(Pgt;0.05)。流式细胞术显示CWTPTEN组细胞周期从G1期到S期已发生抑制。结论：野生型PTEN可依赖其磷酸酶活性抑制肿瘤细胞的增殖，并最终诱导细胞凋亡。 　　【关键词】 人乳腺癌ZR751细胞; PTEN基因;细胞周期 　　PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因)是继p53基因之后新近发现的与各种肿瘤密切相关的一个抑癌基因，其突变与缺失见于多种恶性肿瘤，如前列腺癌、胶质瘤、乳腺癌等。目前发现PTEN是唯一一个编码具有双重磷酸酶活性的抑癌基因[1]，因其凭借磷酸酶活性负调控PI3K/Akt信号传导途径而备受关注。虽有研究表明，PTEN的缺失与突变与乳腺癌的发生发展密切相关[2]，然而目前有关PTEN基因对乳腺癌细胞生长抑制的作用多集中在对乳腺癌组织的研究，而PTEN基因转染对人乳腺癌细胞的研究不多。本实验以外源性PTEN基因导入该基因内源性缺失的乳腺癌细胞ZR751中，通过RTPCR、Western blot 分析目的基因的表达;同时采用MTT法和流式细胞术检测转染后PTEN基因对ZR751细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，以探讨其在乳腺癌细胞株生长抑制过程中的作用机制。 　　一、材料与方法 　　1.1 材料 　　人乳腺癌细胞株ZR751由中国医学科学院基础医学研究所提供。pBPwtPTEN及pBPG129RPTEN质粒由美国加州大学Ludwig癌症研究所Furnari教授惠赠。胰蛋白酶为美国Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青微生物材料工程公司产品。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，嘌呤霉素、DNA Ladder 、DEPC、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等购自美国Sigma公司。RTPCR反应试剂盒购自QIAGEN公司。小鼠抗人PTEN单克隆抗体、山羊抗人Actin多克隆抗体、EXL发光试剂盒购自Santa Cruz 生物技术公司。HRP标记山羊抗小鼠IgG、 HRP标记马抗山羊IgG等其它试剂购自北京中山生物技术有限公司等国内公司。PTEN、GAPDH引物由上海生工公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 ZR751细胞培养于含体积分数为15%胎牛血清，100　U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640完全培养液中，同时细胞培养液加入0.5　U/mL胰岛素，并将细胞于37 ℃、体积分数为5%CO2饱和湿度孵箱中培养，经过消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。 　　1.2.2 质粒转染 按照Lipofectamine 2000说明书分别将编码人野生型PTEN的真核表达质粒pBP wtPTEN和突变型PTEN质粒pBPG129RPTEN转染对数生长期的ZR751细胞，以1.5 mg/L嘌呤霉素持续筛选3周，挑选阳性细胞克隆，扩增培养。分别将成功转染pBP wtPTEN和pBPG129RPTEN质粒的ZR751细胞命名为CWTPTEN细胞和CG129RPTEN细胞，称为CWTPTEN组和CG129RPTEN组。未转染的ZR751细胞作阴性对照称为对照组。 　　1.2.3 RTPCR法检测转染前后PTEN基因的表达 用质量分数为0.25%胰蛋白酶消化，收集培养CWTPTEN、CG129RPTEN和ZR751细胞。制成悬浮液并计算细胞数，每个样本