重组腺病毒载体介导人DeltaNp73α转染对树突状细胞凋亡抑制作.docVIP

重组腺病毒载体介导人DeltaNp73α转染对树突状细胞凋亡抑制作 　 作者：胡义杰 范士志 蒋耀光 李志平 陈建明 何勇 【摘要】 　　目的： 研究人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染人脐血来源树突状细胞（DC）对其成熟状态及其凋亡水平的影响. 方法： 用Adeasy系统构建人DeltaNp73α基因重组腺病毒；并通过增强离心法将其转染至人脐血来源DC；流式细胞仪分析转染后DC的成熟状态以及DC的凋亡水平. 结果： 成功构建了人DeltaNp73α基因重组腺病毒并高效转染DC；人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染提高了DCCD83，HLADR的表达，并能显著抑制其凋亡水平. 结论： 人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染DC，促进DC的成熟并抑制其凋亡，将有效地提高DC疫苗的抗原呈递能力. 【关键词】 DeltaNp73α 重组 遗传 腺病毒科 树突细胞 树突细胞疫苗 0引言 免疫治疗是肿瘤目前极有前景的治疗手段之一. 激活特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是实现肿瘤主动免疫治疗的关键. 树突状细胞(dendritic cell， DC)能摄取特异性相关抗原、高水平的表达与抗原递呈有关的MHCI，MHCⅡ分子、多种共刺激分子及黏附分子，从而激活初始T淋巴细胞. 肿瘤细胞通过分泌一些免疫抑制因子来抑制DC的成熟及其功能，甚至通过相关信号通路诱导DC细胞的凋亡［1］. 具有抑制细胞作用的DeltaNp73α属于p53基因家族，其在肺癌组织中表达量和阳性表达率明显升高，是肺癌免疫治疗中较好的靶点. 我们拟通过构建DeltaNp73α的重组腺病毒（adenovirus, Ad）并转染人DC，使DeltaNp73α在DC内稳定高表达、呈递，并探讨DeltaNp73α高表达对DC活化状态及凋亡水平的影响. 1材料和方法 1.1材料真核表达质粒pcDNA3DeltaNp73αHA由意大利罗马大学Gerry Melino教授和Vincenzo De laurenzi博士惠赠，含DeltaNp73α基因cDNA全长约1700 bp. PAdTrackCMV，293T细胞，E. coli BJ5183，DH5α大肠杆菌由第三军医大学西南医院烧伤研究所提供. KpnI， XbaI， PmeI， PacI限制性内切酶以及T4DNA连接酶（NEB公司）；脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒（Invitrogen公司）；大小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA PCR Kit（TaKaRa公司）；人淋巴细胞分离液（Bamp;D公司）；人白细胞介素IL4，人粒单核集落刺激因子GMCSF，肿瘤坏死因子TNFα（Perprotech公司）；AntiHA Tag Mouse monoclonal Antibody（Applygen公司）；Tripure Reagent（百泰克生物公司）；MCCelLytics Mammalian Cell Protein Extraction Reagent，BCA蛋白质定量测定试剂盒（上海申能博彩生物公司）；goat antimouse IgG/HRP二抗（Biosythesis公司）；PEantiCD1a,PEantiCD83,PEantiHLADR及其同型对照（美国BioLegend公司）；PEAnnexin V凋亡试剂盒（晶美生物公司）. 根据GenBank中DeltaNp73α cDNA的序列，应用Primer 5软件设计针对其的特异引物并由Invitrogen公司合成. 1.2方法 1.2.1复制缺陷性腺病毒AdDeltaNp73α的构建复制缺陷性腺病毒AdDeltaNp73α含全长人DeltaNp73α cDNA，由我科通过AdEasy系统构建. 50%组织培养转染剂量法（TCID50）测得病毒的滴度（M.O.I）为2.5×1011pfu/L. 1.2.2人脐带血来源DC的分离培养经产妇同意后，取剖腹产时新生儿脐带血（125×103 U/L肝素抗凝），经人淋巴细胞分离液密度梯度离心法［2］分离出单个核细胞，37℃, 50 mL/L CO2孵箱孵育. 2 h后转移未贴壁细胞至另一离心管供分离T细胞，贴壁细胞更换含有细胞因子IL4（1000×103 U/L），GMCSF（1000×103 U/L）的培养基继续培养. 间隔1 d半量更换培养基，补充细胞因子IL4, GMCSF. 第6日收获未成熟DC（immature dendritic cells, iDC）；或者第5日换液时加入TNFα（50×103 ng/L），刺激48 h后即第7日收获成熟DC（mature dendritic cells, mDC）.