金钗石斛提取物抗白内障体外实验探究.docVIP

金钗石斛提取物抗白内障体外实验探究 　 ; 作者：龙艳 魏小勇 詹宇坚 ;李熙灿 徐传磊 徐勤 【摘要】; 　　【目的】探讨金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)总生物碱和粗多糖对白内障的抑制作用。 【方法】采用溶剂法分离提取金钗石斛总生物碱和粗多糖；体外培养大鼠晶状体,加入H2O2与总生物碱（或粗多糖）共培养24h；分别在培养后6、12、18、24h共4个时段于解剖显微镜下观察并记录晶状体混浊度的改变；检测晶状体水溶性蛋白、谷胱甘肽（GSH）的含量及总超氧化物歧化酶（TSOD）和丙二醛（MDA）的活性。 【结果】金钗石斛总生物碱和粗多糖均能减轻晶状体混浊度，并能显著升高晶状体水溶性蛋白、GSH含量及TSOD活性，降低MDA的活性（均Ｐ＜０.０５），其中石斛总生物碱高剂量组效果最佳。 【结论】金钗石斛总生物碱和粗多糖在体外均有一定的抗白内障作用，其机制与拮抗晶状体的氧化损伤有关，而总生物碱的效果优于粗多糖。 【关键词】; 金钗石斛/药理学 金钗石斛/化学 白内障/中药疗法 晶状体 /病理学 器官培养 　　白内障(cataract)是一种常见的致盲眼病，它是多种因素共同作用的结果，氧化损伤是其发病机制之一［1］。当前许多中药研究都是从提高晶状体抗氧化能力入手，利用抗氧化剂或抗氧化酶激活剂来消除或中和晶状体中的氧化产物，阻止或逆转晶状体变浑浊，从而抑制或延缓白内障的发生发展［2］。石斛是一种名贵中药材，抗白内障是其主治功效之一。已有研究证实，石斛水煎剂可通过改变晶状体相关酶的活性而对D半乳糖性白内障起到防治作用［3］，石斛的乙酸乙酯提取物在体外还可抑制醛糖还原酶和过氧化脂质（LPO）的产生［4］，这些研究在一定程度上揭示了石斛抗白内障的作用机理。然而，石斛化学成分复杂，其抗白内障的具体有效成分是什么，至今仍未见报道。本实验通过体外培养晶状体，对金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)的粗提物总生物碱（total alkaloids）和粗多糖（polysaccharides）抗白内障作用进行了探讨，现报道如下。 ; 　　1; 材料和方法 　　1.1; 动物; 4～5周龄Wistar大鼠20只,体质量80～120g，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：粤临证字2007A025。 　　1.2; 药材和试剂; 金钗石斛由贵州赤水信天石斛有限公司提供，经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定。DMEM低糖培养基（杭州吉诺生物医药技术有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，福州迈新生物技术开发公司）；体积分数30%过氧化氢（H2O2，浙江临安化工二厂）；吡诺克辛钠滴眼液（武汉天天明药业有限责任公司，批号：070102）；Bradford蛋白质定量试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）；谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品；其他试剂均为国产分析纯。 ; 　　试剂配制如下。改良碘化铋钾试剂：甲液：0.85g次硝酸铋溶于10mL冰醋酸，加水40mL;乙液：8g碘化钾溶于20mL水中；将甲液与乙液等量混合后，取1mL与2mL醋酸混合，供生物碱的显色用。Molish试剂：甲液：α萘酚1g，加体积分数75%乙醇至10mL；乙液：浓硫酸；供多糖的检测用。 　　1.3; 仪器; E52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZDIII型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；BS110S型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；HI98128型pH计（北京HANNA）；SWCJIF型超净台（苏州净化设备厂）；Galaxys型CO2培养箱（美国RS Biotech）；STPT型解剖显微镜（日本OLYMPUS）；5810R型低温高速离心机（德国Eppendorf ）；7200型分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）。 　　1.4; 金钗石斛总生物碱和粗多糖的分离提取及检识; 金钗石斛总生物碱和粗多糖的提取方法参照文献［5-6］并略加改进：干燥金钗石斛切碎打成粗粉，加入体积分数为95%乙醇85℃回流提取（4h/次×3次），合并提取液，减压回收乙醇后得到石斛浸膏，加1moL/L HCL调节浸膏的pH为3，氯仿萃取3遍后，弃氯仿层，加浓氨水调母液pH=11，再经氯仿萃取3遍，将氯仿层合并，减压浓缩，挥干氯仿后即得到总生物碱。将醇提后的药渣晒干后加入20倍体积的水，100℃回流提取（2.5h/次×4次），合并提取液，减压浓缩至一定容积后，加入体积分数95%乙醇，直至醇浓度为70%，置于冰箱内，隔夜取出沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤3遍，再经Sevag法除蛋白处理，冷冻