COX2基因在大肠癌表达及其意义.doc

COX2基因在大肠癌表达及其意义 　 作者：王淑强 李秀娟 李鹏 武欣 王琳冬 【摘要】 目的 探讨COX2基因在大肠癌中表达的意义。方法 收集手术切除的大肠癌标本58例，同时选取大肠癌远端正常黏膜组织10例，应用流式细胞术（FCM）检测大肠癌及正常黏膜中COX2表达情况，根据平均荧光强度计算荧光指数（FI）。 结果 COX2表达平均FI值正常黏膜组为1.00±0.28，高、中、低分化及黏液癌组分别为2.47±1.41、2.70±1.08、3.16±1.34和2.01±1.43，高、中、低分化及黏液癌组COX2表达均明显高于正常黏膜组（P＜0.01）；大肠癌淋巴结转移组平均FI值（2.45±1.41）显著高于无淋巴结转移组（1.61±1.27）（P＜0.05）。COX2的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的发生部位等无关。结论 COX2在大肠癌中表达异常增高，并与淋巴结转移密切相关。 【关键词】 大肠癌；COX2；流式细胞术 　　近年来研究表明，环氧合酶(COX)2在多种肿瘤中均呈高表达，在肿瘤发生、发展、分化、转移中起重要作用。在细胞癌变过程中，Wnt通路异常变化可能具有重要作用，COX2是Wnt通路的靶基因，可通过增强MMPs的表达，促进肿瘤的转移〔1〕。本研究采用流式细胞术检测大肠癌及大肠远端正常黏膜中COX2的表达情况，探讨COX2在大肠癌发生、发展和转移中的作用，为预测大肠癌浸润和转移提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 一般资料 　　收集手术切除的大肠癌标本58例，男28例，女30例，年龄30～78岁（平均58.3岁）。病变部位：结肠癌22例，直肠癌36例；分化程度：高分化腺癌26例，中分化腺癌20例，低分化腺癌6例，黏液腺癌6例；转移情况：有淋巴结转移31例，无淋巴结转移27例。同时选取大肠癌远端正常黏膜组织10例。 　　1.2 方法 　　1.2.1 试剂 　　兔抗人COX2单克隆抗体（Santa Crus Biotechonlogy，INC），羊抗兔IgGFITC，DAB显示剂，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 　　1.2.2 实验步骤 　　单细胞悬液的制备：石蜡包埋组织HE染色，切成40 μm厚的组织片5片，放入10 ml的试管中，加入二甲苯8 ml，在室温下脱蜡2 d，其间更换2次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5 ml，每步10 min，加入蒸馏水 5 ml，10 min后弃之。加入2 ml 0.5%胰蛋白酶（pH1.5）消化液，置37℃恒温水浴中消化30 min，在消化期间，每隔10 min用振荡器振荡1次，消化30 min后，立即加生理盐水终止消化，经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第二次消化。收集细胞悬液，以1 500 r/min离心沉淀5 min，再用生理盐水漂洗2次，以800 r/min离心沉淀5 min，去碎片。细胞的免疫荧光标记：取单细胞悬液1×106/ml，加入兔抗人COX2单克隆抗体工作液0.1 ml室温孵育30 min，加入PBS 10 ml 洗涤1次，弃上清，加入羊抗兔FITCIgG二抗工作液10 ml，避光室温孵育30 min，加入PBS 10 ml，800 r/min离心沉淀5 min，弃上清除去未结合的荧光二抗，上机检测并加入PBS 0.1 ml 经500目铜网过滤后上机检测。蛋白免疫荧光标记物测定设一抗或二抗的本底对照和阴性对照。检测条件及参数采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXLII型流式细胞仪，应用Expo32 ADC软件分析数据。测定前以Flow check标准微球调整仪器的CV值在2%以内。 　　1.2.3 结果判定 　　根据流式细胞仪分析软件测定出的平均荧光强度（Mode值）计算荧光指数（FI），并以FI表示COX2基因蛋白表达的强弱。FI=（样品基因蛋白的表达荧光强度-正常样品的荧光强度）/正常样品的荧光强度。 　　1.3 统计学处理 　　 　　数据分析采用SPSS11.0统计软件进行统计分析。数据用x±s表示，采用单因素方差分析。 　　2 结 果 　　2.1 COX2基因在正常黏膜和不同分化组中的表达 　　COX2表达平均FI值正常黏膜组为1.00±0.28，高、中、低分化及黏液腺癌组分别为2.47±1.41、2.70±1.08、3.16±1.34和2.01±1.43，高、中、低分化及黏液腺癌组COX2表达均明显高于正常黏膜组（P＜0.01）。 　　2.2 COX2基因在大肠的表达与临床病理特征的关系 　　见表1。大肠癌COX2基因表达在有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组（P＜0.05），与大肠癌患者的年龄、性别、肿瘤的发生部