CRBP-1基因RNAi慢病毒载体构建及鉴定.doc

CRBP-1基因RNAi慢病毒载体构建及鉴定 　 作者：陈波，李建平，戴途，吴志勇，罗蒙，孙勇伟 【摘要】 目的：构建大鼠视黄醇结合蛋白-1(cellular retinol-binding protein- I ，CRBP-1)基因RNAi（RNA interference， RNAi）慢病毒载体。方法：针对已经筛选确定的大鼠CRBP-1 基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Hpa I 和Xho I酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体，PCR 筛选阳性克隆，测序鉴定。结果：PCR 鉴定与DNA测序证实合成的含CRBP-1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。结论：成功构建大鼠CRBP-1基因RNAi 慢病毒载体。 【关键词】 RNA干扰；视黄醇结合蛋白-1；慢病毒 [Abstract] Objective：To construct a lentiviral vector of RNA interference（RNAi） of rat cellular retinol-binding protein I (CRBP-I) gene. Methods：The effective sequence of siRNA targeting CRBP-I gene was confirmed in our previous study. The complementary DNA containing both sense and antisense Oligo DNA of the targeting sequence was designed，synthesized and cloned into the pGCL-GFP vector，to construct a lentiviral vector which expressed short hairpin RNA(shRNA)， and it was identified by PCR and DNA sequencing. Results：PCR identification and DNA sequencing demonstrated that insertion of oligonucleotide of the lentivirus RNAi vector containing CRBP-I shRNA was right. Conclusion：The lentivirus RNAi vector of rat CRBP-I was constructed successfully. [Key words] RNA interference；Cellular retinol-binding protein I；Lentivirus 肝星状细胞（hepatic stellate cells， HSC）的激活过程是肝脏胶原产生和肝纤维化形成的中心环节[1]，在肝纤维化逆转过程中也起重要作用，2002年Uchio K[2]在用CCl4制备大鼠肝纤维化模型中发现，活化第5天的HSC中CRBP-1表达明显增加，而视黄醇脂滴消失，提示CRBP-1与肌成纤维样细胞的形成密切相关。近年来，随着RNAi技术的出现，为研究内源性基因功能和信号转导途径提供了强有力的研究工具。我们在已经获取CRBP-1基因的RNAi 有效靶序列的基础上，设计、构建和鉴定表达CRBP-1 shRNA的慢病毒载体，为后期研究CRBP-1 基因在HSC活化中的作用机制和肝纤维化的基因治疗打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料 PCR用试剂 primer、dsDNA Oligo （上海吉凯基因技术有限公司合成），大肠杆菌菌株DH5α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶（ Invitrogen 公司）。慢病毒载体系统（ Tronolab 公司www. tronolab. com/ lentivectors.php）. 该病毒包装系统由pGCL-GFP载体，pHelper 1.0(gag/pol 元件)载体，Helper 2.0 (VSVG元件)载体三质粒组成，其中pGCL-GFP载体含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达荧光蛋白marker(GFP/RFP)，pHelper 1.0和pHelper 2.0含有病毒包装所必须的元件。 限制性内切酶、T4DNA连接酶（New England Biolabs公司）。 1.2 方法 1.2.1 双链DNA Oligo制备 用Ambion 公司的设计软件，设计、合成3 对针对CRBP-1 基因shRNA的寡核苷酸序列，经分别构建质粒，转染293细胞，据其对CRBP-1 的抑制率，确定有效靶