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Cx32基因在肝癌细胞株中表达及甲基化调节作用 　【摘要】 ［目的］ 了解Cx32基因在肝癌细胞株（HepG2）中的表达及甲基化调节作用。［方法］ 采用不同药物浓度的甲基化转移酶抑制剂(5-杂氮脱氧胞苷5-Aza-CdR)分三组培养细胞株，免疫组化分析Cx32蛋白表达，甲基化特异性PCR检测Cx32基因的甲基化状态。［结果］肝癌细胞株Cx32蛋白表达减少，去甲基化后Cx32基因表达增加且定位异常，细胞生长减慢，三组细胞总阳性率分别为18.5％、77％、88％，具有显著性差异(P＜0.01)。三组细胞Cx32基因甲基特异性PCR结果分别为甲基化、部分去甲基化及完全去甲基化。［结论］肝癌细胞株（HepG2株）中Cx32表达减少，受甲基化抑制，去甲基化可增加Cx32表达。 【关键词】 肝肿瘤 连接蛋白32 甲基化 连接蛋白32（connexin32，Cx32）是正常肝脏中主要表达的连接蛋白之一，对维持肝细胞的正常功能具有重要作用，Cx32表达异常与肝癌的发生发展有关，是肝癌抑癌基因[1]，其下调机制不是很清楚。国外研究提示肾癌中Cx32受到甲基化抑制[2]，本文进一步研究肝癌细胞中Cx32表达下调是否与基因甲基化有关，探索增加或恢复肝细胞癌中Cx32正常表达的可能机制。 1 材料与方法 1.1 材 料 HepG2肝癌细胞株（湘雅医学院中心试验室细胞库提供）；鼠抗Cx32及二抗试剂盒（Zymed公司）；QIAamp DNA抽提试剂盒(QIAGEN公司)；5-Aza-CdR、亚硫酸氢那钠、氢醌（Sigma公司）；DNA纯化试剂盒(Promega公司)。引物参照文献设计如下：甲基化引物：sense 5′-GGGGCGGGTGCGGCGAT-3′、antisense 5′-CTCCGCGCCTGCGCCC-3′；非甲基化引物：sense5′-GGGGTGGGTGTGGTGAT-3′、antisense 5′-CTCCACACCTACACCCAA-3′。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，OD值均为2，扩增片段均为245bp。 1.2 研究方法 细胞培养及处理：肝癌细胞株（HepG2）采用含双抗（青霉素、链霉素100U/L）及10％胎牛血清的高糖型DMEM培养，按不同5-Aza-CdR浓度分三组（0μmol/L组、1μmol/L组、5μmol/L组），分别在25cm2培养瓶和带玻片的6孔培养板中培养，每组培养瓶5瓶、培养板5板，重复3次。取对数期生长细胞，每瓶和每孔分别接种细胞2×104、8×103。先用不含药物的培养液培养24h待细胞贴壁后弃去培养液，换用含相应药物浓度的培养液继续培养72h，每天在显微镜下观察、计数细胞（计数按血细胞计数方法）一次，重复计数结果取均值列表并进行统计分析。 细胞免疫组化：按试剂盒说明采用ABC三步法。结果判断：参照Barnes等[3]方法进行半定量评分（分A、B项）：A项，按切片中细胞显色深浅计分：0分：细胞无显色，1分：显浅黄色，2分：显黄色，3分：显棕黄色；B项，按显色细胞的比例评分：1分：1%~30％，2分：31%~75％，3分：76%~100％。两项指标结合积分：阴性（-）积分为0分；阳性（+）积分1~4分；强阳性（++）积分5~6分。每组计数5个视野，每个视野计数200个细胞。 甲基化特异性PCR：参照说明提取、亚硫酸氢钠及氢醌等修饰、提纯DNA，PCR反应体系50μl，反应条件：94℃变性2min；94℃变性30s、70℃退火1min、72℃延伸30s循环40次；72℃延伸5min。 1.3 结果判断 甲基化阳性为M阳性、U阴性；部分去甲基化为M阳性、U阳性，但OD值减弱；完全去甲基化为M阴性、U阳性。 1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包，分别采用多因素方差（MANOVA）分析、Kruskal-Wallis H检验和Nemenyi检验，P＜0.05有统计学意义。 2 结 果 2.1 细胞培养结果 显微镜下观察细胞培养，随着5-Aza-CdR的剂量递增，细胞数增殖减慢，细胞形态变得较规则，病理性分裂减少。各组细胞计数结果取均值列表（见表1）， MANOVA分析，具有显著性差异（F=56.13，P＜0.01）。 　 2.2 细胞免疫组化结果 结果表明：Kruskal-Wallis H检验 H＝204.32，P＜0.01；采用Nemenyi法检验两两比较，χ21,2＝258.33，χ21,3＝391.83，χ22,3＝13.85，P值均＜0.01。表明经甲基化酶抑制剂处理后Cx32表达定位异常（主要表达于胞浆）、表达增加，各组间差异均有显著性，即2组高于1组，3组高于2组。见表2，图1~5。 2.3 甲基化检测结果 甲基化检测结果见图6。1组为