CXCR4-CXCL12在肺癌转移中初步探究.doc

CXCR4/CXCL12在肺癌转移中初步探究 　 作者：石新云 童永清 孙小军 　肿瘤转移是一个具有高度组织性和器官选择性的复杂连续过程， 虽然已证明很多因素参与肿瘤的转移，但是不同组织来源的肿瘤细胞迁移、侵袭到特定部位的分子机制还不清楚。趋化因子是一组结构相关的小分子，具有调节各种类型的白细胞迁移、吸引具有特定的趋化因子受体的炎症细胞浸润到炎症部位参与炎症反应的作用。 不同组织类型的肿瘤细胞常见的转移部位不同,趋化因子及受体是否如趋化炎症细胞的定向移动一样来参与调节肿瘤细胞的定向迁移与转移成为目前研究的热点。近来的研究表明，趋化因子受体及配体与肿瘤细胞的定向迁移、侵袭和转移有密切关系［１，２］。为探索趋化因子受体及配体CXCR4/CXCL12 在肺癌细胞迁移中的作用，作者检测肺癌组织、肺癌细胞系A549、血管内皮细胞系VEC 中趋化因子受体CXCR4 以及肺癌患者胸水与淋巴组织中趋化因子CXCL12 的表达，并对其趋化活性进行相应分析，以期为趋化因子受体及配体CXCR4/CXCL12 诱导肺癌细胞的定向迁移提供实验依据。 　　1 资料与方法 　　1.1 研究对象 　　(1)细胞系：A549细胞株为人肺腺癌细胞株，VEC细胞株为人血管内皮细胞株，均由中南大学肿瘤研究所保存、提供。(2)临床标本：选取2004 年8 月至2005 年8月本院手术肺癌21例，年龄23～72岁（中位年龄51岁），其中大细胞性肺癌12例，小细胞性肺癌7例，未分化癌2例；TNM分期I期5例 ，II期7例，III期7例，IV期2例。同期手术的良性肺部肿瘤17例作对照组，年龄31～60岁（中位年龄43岁），取其正常肺组织（经术后病理学检查证实）进行实验。 　　1.2 研究方法 　　(1)标本的采集：术中收集肺癌患者的肺癌组织，颈部淋巴结组织，支气管平滑肌组织以及良性肺肿瘤患者切除的正常肺组织，置液氮中保存，同时收集无血液污染的上述肺癌患者的胸水置于无菌离心管，4℃保存，于4h内检测CXCL12 的趋化活性，或-70℃保存（检测CXCL12的含量）。(2)肺癌患者胸水中趋化因子的检测：CXCL12 的含量用ELISA试剂盒（Ferment公司）检测。(3)CXCR4和CXCL12 mRNA表达水平的测定：将肺癌组织、颈部淋巴结组织、支气管平滑肌组织及良性肺肿瘤组织在液氮中研磨为粉末状，然后与A549、VEC细胞均用TRIzol试剂一步法提取组织/细胞中的总RNA,用MMLV逆转录酶进行逆转录,PCR扩增CXCR4和CXCL12,同时扩增GAPDH作为内参照.CXCR4引物序列为:正义链5’-AGCTGTTGGTGAAAAGGTGGTCTATG-3’反义链5’-GCGCTTCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3’；CXCL12引物序列为:正义链5’-CCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3’,反义链5’- CTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3’。CXCR4和CXCL12 产物的扩增长度分别为260bp和227bp。PCR反应条件：94℃,预变性2min,然后 94℃变性60s, 56℃ 退火60s,72℃延伸60s,共30个循环,最后再72℃延伸10min后结束反应。 PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统成像，并确定条带的光密度值。整个RT-PCR过程独立重复3 次，以3次实验所得光密度值的平均数表示mRAN 含量。(4)Western Blot 分析：将同样大小肺癌组织及正常肺组织匀浆，以去污剂细胞裂解液将组织匀浆及细胞裂解，参照文献方法［３］提取蛋白。取80μg蛋白质样品进行SDS电泳、转膜、温封闭1h 后，加入0.05%Tween20的TBS 缓冲液稀释的CXCR4兔抗人单克隆抗体（1：500），4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1：1000），37℃温育1h，增强化学发光系统显色。利用投射仪图像分析系统扫描确定X线片上杂交条带的光密度值，实验独立重复3 次，以所得光密度值的平均数表示蛋白含量。(5)趋化活性分析：以48孔微趋化板，分别检测重组人CXCL12和肺癌癌性胸水对CXCR4阳性细胞的趋化作用。参照文献［４］：下室分别加入不同浓度（0.1-200ng/ml）的重组人CXCL12或肺癌癌性胸水，同时以无趋化因子的培养基作阴性对照，均为3复孔，上室中加入A549、VEC细胞，上下室之间铺上10μm孔径的PVP聚碳酸膜，于37℃含5%CO2孵箱中孵育4.5h，以PBS 棉签拭去膜背面的细胞，70%的甲醇固定，苏木精染色，计数至少5个视野（光镜， 放大200倍）的细胞数。计算趋化指数CI（迁移到含有不同浓度趋化因子液体膜侧的细胞数与迁移到阴性对照液膜侧的细胞数