FLT3基因突变及IL3受体α在急性髓系白血病表达意义.docVIP

FLT3基因突变及IL3受体α在急性髓系白血病表达意义 　 作者：吴勇, 陈景龙, 骆社丹, 陈元仲 【摘要】 目的 研究FLT3 基因突变与IL3受体α(IL3Rα)在急性髓性细胞白血病(AML)的表达及临床意义。 方法 采用RTPCR及限制性片段长度多态性(RFLP)分析检测20 例AML患者IL3Rα的表达水平及FLT3/ITD与D835突变。 结果 20 例中IL3Rα高表达18例,FLT3/ITD 突变7 例,D835突变1 例,总突变率44.4%,对照组未检测到FLT3/ITD 突变。高表达IL3Rα与FLT3/ITD 阳性患者外周血白细胞计数高,白血病细胞比例高,完全缓解率低。 结论 IL3Rα高表达和 FLT3基因突变均赋予急性髓系白血病细胞增殖优势,检测两者水平对于评价AML患者疗效、估计预后具有重要意义。 【关键词】 受体蛋白质酪氨酸激酶； 串联重复序列； 突变； 受体，白细胞介素3； 白血病，粒细胞，急性 　　急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种涉及多基因遗传学改变的恶性血液病,其特征为细胞分化成熟受阻,未分化细胞大量增殖。目前认为白血病幼稚细胞起源于被称为白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC)的细胞,而LSC 则被认为是由相应的正常细胞发生至少两次突变后形成的异常产物。FLT3基因(FMS样酪氨酸激酶3,FMSlike tyrosine kinase3)是Ⅲ型酪氨酸激酶家族成员的原癌基因,FLT3基因突变是AML最常见的基因突变,主要包括内部串联重复突变(internal tandem duplication,ITD)和D835突变。IL3受体是造血细胞因子受体超家族成员之一,IL3受体α亚基(IL3Rα,又叫CD123)是白血病干细胞的特异性标志,其蛋白表达产物CD123在LSC中高度表达,而在正常的造血干细胞中不表达或表达很低[1]。本研究旨在探讨两者与急性髓系白血病的疗效和预后的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 临床资料 　　1.1.1 标本采集和单个核细胞(MNC)的制备 收集福建医科大学附属协和医院血液科2005年3月－2006年6月住院的20例急性髓系白血病患者外周血,年龄中位数35岁(32±3岁)。根据FAB形态学分型,20例患者包括急性原粒细胞白血病未分化型(M1)3例,急性原粒细胞白血病部分分化型(M2)7例,急性早幼粒细胞白血病(M 3)4例,急性单核细胞白血病(M5)6例,外周血幼稚细胞均＞60%,用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞(MNC),用PBS液洗涤细胞2遍,-80 ℃保存备用。同时采集4例正常人外周血单个核细胞为对照。 　　1.1.2 仪器与试剂 Trizol试剂(美国GIBCOL公司),反转录试剂盒(Omniscript RT kit,德国Qiagen公司),PCR试剂盒(HotStar Taq Master mix kit,德国Qiagen公司),限制性内切酶EcoR V(美国 New England Biolabs公司),琼脂糖(美国AMRESCO 公司)。 　　1.2 细胞总RNA提取及cDNA合成 用Trizol试剂提取细胞总RNA,在紫外分光光度计上读取总RNA的260 nm、280 nm吸光度值(D),要求D260/D280gt;1.8。用反转录试剂盒将上述样本的总RNA反转录成cDNA,逆转录反应体系20 μL,包括细胞总RNA 1 μg,10×逆转录反应缓冲液2 μL,5 mmol/L dNTPs 2 μL,10 μmol/L oligo dT20引物2 μL,10 U/μL RNA酶抑制剂 1 μL,4 U/μL反转录酶1 μL,余用无核酸酶水补至20 μL。在37℃中反应60 min,95℃反应5 min灭活逆转录酶,-20℃保存备用。 　　1.3 RTPCR扩增IL3Rα mRNA的表达水平和FLT3ITD突变 PCR采用HotStar PCR试剂盒,PCR反应体系25 μL：Hotstar Taq Master mix 12.5 μL,cDNA 1.5 μL,10 pmol/μL上、下游引物各0.2 μL,余用水补至25 μL。 PCR反应条件：95 ℃预变性15 min,然后进入循环（94 ℃ 变性30 s→54 ℃或61 ℃退火45 s→72 ℃ 延伸60 s)共30循环,72℃延伸10 min。PCR所用的引物及PCR产物的预期片段为： 　　IL3Rα： 　　上游：5CTGTCTCCTGCAAACGAAGG3’ 　　下游：5GTTGACGCCTGTTGGCAACG3’ 　　预期片段479 bp。 　　FLT3/IT