SHP1表达及慢性粒细胞白血病进展初步探究.docVIP

SHP1表达及慢性粒细胞白血病进展初步探究 　【摘要】 目的： 探讨SHP1表达与CML急变的关系；构建SHP1真核表达载体. 方法： 应用RTPCR比较慢性期和急变期CML患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平；SHP1真核表达载体pcDNA3.0SHP1的测序，检测其mRNA和蛋白表达. 结果： 急变期患者SHP1转录本水平明显下降，与正常对照间存在统计学差异；pcDNA3.0SHP1转染K562细胞，可表达SHP1 mRNA和蛋白. 结论： SHP1的表达下调可能与CML由慢性期朝加速/急变期演化过程有关；成功构建了SHP1真核表达载体pcDNA3.0SHP1. 【关键词】 白血病 髓样 进展期 SHP1 0引言 慢性髓系白血病（chronic myeloid leukaemia, CML）是一种累及造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病，近90％的患者肿瘤细胞中可以检测到BcrAbl融合基因，该基因催化自身和一系列底物的酪氨酸残基（tyrosine residue，Tyr）发生过度磷酸化，导致多个信号传导通路的异常激活，最终导致CML的发生. SHP1是蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）家族的重要成员，能够通过催化受体Tyr残基“去磷酸化”抑制信号传导. 我们应用RTPCR比较了慢性期和急变期CML患者原代细胞中SHP1的mRNA转录本水平，并克隆SHP1全长cDNA序列，构建真核表达载体，以用于进一步研究SHP1在CML发病及进展中的潜在作用. 1对象和方法 1.1对象CML患者11（男6，女5）例，中位年龄28岁. 患者骨髓单个核细胞经按G显带制备染色体及核型分析和/或间期荧光原位杂交检测发现有Ph染色体和或/BcrAbl融合基因（表1），临床诊断慢性期7例，急性期4例. 正常对照选择骨髓未受浸润的恶性淋巴瘤患者3例. 均抽取无菌肝素抗凝骨髓3～5 mL，Ficoll分离单个核细胞，预冷PBS（pH=7.4）洗涤细胞2遍备用. HEL细胞和K562细胞购自上海细胞生物研究所；RPMI1640培养基为Gibco产品；胎牛血清为杭州四季青产品；MMLV逆转录酶和Taq酶为Promegar产品；总RNA提取试剂和Oligo(dt)15购自上海博彩公司；抗SHP1多克隆抗体购自BD Transduction Laboratories公司；RIPA细胞裂解液和低分子量蛋白Marker购自上海申博生物公司；人红白血病细胞HEL和CML急变K562细胞在含100 mL/L胎牛血清的PRMI1640培养液中，于37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度的培养箱中培养, 每24～36 h传代1次, 取对数生长期细胞进行实验.表111名CML患者的临床资料序 1.2方法 1.2.1CML患者SHP1 mRNA的表达SHP1上游引物：5′ACATTCTCCCCTTTGACC 3′，下游引物：5′CTCAGGTACTGGTAATGCC 3′，扩增产物414 bp［1］. 细胞中甘油醛3磷酸脱氢酶（GAPDH） cDNA的水平也被检测作为内对照，GAPDH上游引物：5′AATCCCATCACCATCTTCCA 3′，下游引物：5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG 3′，扩增产物590 bp. 实验组和对照组细胞同时各取5×106，Trizol提取总RNA. 反转录体系25 μL，包括RNA 2 μg，引物Oligo(dt)15 0.5 μg，RNasin 500 nkat，4种dNTP浓度各为500 μmol/L，MMLV逆转录酶3334 nkat，42℃反转录1 h，95℃ 5 min结束反应. PCR反应体系为20 μL，包括反转录产物2 μL，寡核苷酸引物各20 pmol，4种dNTP浓度各为200 μmol/L，Taq酶6.7 nkat. 扩增条件：94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 60 s，循环 29次，72℃ 10 min结束反应. 扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，凝胶图像光密度分析仪记录图像并行吸光度分析，视频打印结果. 1.2.2RTPCR克隆SHP1基因全长cDNA序列上游引物：5′ATAAGCTT HindⅢ GATGGTGAGGTGGTTTC 3′；下游引物：5′GCCACCTGAGGACAGCTTAAG EcoRIAT 3′. 在上游引物5′末端引入HindⅢ酶切位点, 在下游引物3′末端引入EcoRI酶切位点. 取1×107个HEL细胞，Trizol提取总RNA. PCR反应体系为25 μL，包括反转录产物3 μL，寡核苷酸引物各20 pmol，4种dNTP浓度各为200 μmol/L，Taq酶6.7 nka