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IGF1R真核表达及单克隆抗体制备 　 作者：张翠珍, 余君铭△, 周敏, 刘世国, 高慧萍, 田淑君, 李宗海 【摘要】 　　目的: IGF1R稳定表达株的建立和抗IGF1R单克隆抗体（mAb）的制备。方法: 从cDNA扩增得到人全长IGF1R基因, 构建成含有ETag的质粒。用此质粒建立稳定表达IGF1R的细胞株, 并免疫BALB/c小鼠, 经融合、 筛选制备特异性mAb。结果: 成功构建IGF1R病毒质粒, 并筛选得到稳定表达IGF1R的3T3细胞, 该细胞免疫BALB/c小鼠后筛选得到6株稳定分泌抗IGF1R抗体的杂交瘤细胞株, Western blot结果显示抗体8G3能特异性识别抗原。结论: 成功制备了IGF1R的mAb, 为进一步研究IGF1R在肿瘤治疗中的作用提供了有力的工具。 【关键词】 IGF1R; 真核表达; 杂交瘤; 单克隆抗体 　　胰岛素生长因子1受体（insulin growth factor I receptor, IGF1R）及其配体IGF在肿瘤发生和转移中的作用研究是近年来的热点。研究发现, IGF1通过IGF1R的介导, 可以在其他生长因子缺乏的情况下, 促使细胞增殖周期完成［1］, IGF1R在细胞表面的表达量和细胞阻止凋亡的能力成正比［2］。已经有很多研究表明, IGF1R与肿瘤的产生, 发展和转移密切相关［3, 4］。可见阻止IGF1R的生物学功能, 具有很大的临床应用前景。我们用真核表达的IGF1R作为抗原, 制备了特异性单克隆抗体(mAb), 为研究IGF1R在肿瘤治疗领域的应用提供了有力的工具。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 质粒pWPXL、 PMD2G、 PAX2均由瑞士日内瓦大学T.Didier博士惠赠、 大肠杆菌Top10株, HEK 293T细胞系、 NIH HeLa细胞、 NIH 3T3细胞系以及Sp2/0细胞均由本室保存; 限制性内切酶BamH I、 EcoR I和Nde I均购自大连宝生物公司; 血液采自健康人; 胶回收试剂盒购自华舜生物工程有限公司。HRP山羊抗小鼠IgG是Sigma公司产品。抗ETag抗体是GE Healthcare产品。BALB/c小鼠由上海市肿瘤研究所实验动物中心提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养和传代 HEK 293T、 NIH HeLa和NIH 3T3细胞系培养条件为: 在37℃、 50 mL/L CO2的培养箱中, 用含有100 mL/L胎牛血清（NIH 3T3用小牛血清）, 100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养液培养, 并用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。取处于对数生长期, 生长状态良好的细胞用于实验。 　　1.2.2 人cDNA的制备 取6 mL稀释血液（PBS等比稀释）, 加入3 mL淋巴细胞分离液, 400 g, 室温离心20 min。取单个核细胞, 加入5倍PBS, 400 g, 室温离心10 min, 重复1次, 去上清, 加入1 mL TRIzol/106细胞, 室温静置5 min, 加200 μL氯仿, 剧烈震荡1 min, 室温静置5 min, 12 000 g, 4℃离心15 min。取上清于另一离心管, 加等体积异丙醇沉淀, -20℃放置10 min, 12 000 g, 4℃离心15 min, 去上清, 加入750 mL/L乙醇500 μL洗1次, 加适量DEPC水溶解, 行RTPCR。反应条件: 70℃ 5 min, 25℃ 5 min, 42℃ 1 h, 70℃ 15 min。 　　1.2.3 引物的设计 从GenBank获得人全长IGF1R基因序列, 并据此设计引物。正向引物P1为: 5′CGGGATCCATGAAGTCTGGCTCCGGAG3′含BamH I酶切位点; 逆向引物P2为: 5′CGGAATTCGCAGGACGAAGACTGGGG3′含EcoR I酶切位点。 　　1.2.4 IGF1R基因的扩增、 克隆及测序 以人cDNA为模板, P1和P2为引物, 扩增目的基因。PCR反应条件: 94℃ 4 min, 然后94℃ 45 s, 57℃ 45 s, 72℃ 4 min, 共30个循环, 再于72℃延伸10 min。回收PCR产物。空载体pWPXL和ETag（序列为ggtgcgccggtgccgtatccggatccgctggaaccgcgt）用EcoR I和Nde I双酶切后连接, 再经双酶切去掉自带的GFP片段形成新载体pWE, 测序确认。用BamH I和EcoR I双酶切PCR产物和pWE, 回收片段, 连接, 转化Top10感