IL-1β对人晶体上皮细胞中NO及iNOS活性影响.docVIP

IL-1β对人晶体上皮细胞中NO及iNOS活性影响 　 【关键词】 白细胞介素-1β;一氧化氮;诱导型一氧化氮合酶;人晶体上皮细胞;白内障 　　白内障是常见多发的眼科疾病，也是视力障碍和致盲的重要眼病之一，现代白内障囊外摘除联合人工晶体植入术是目前最有效的治疗方法。但白内障囊外摘出术后的后囊膜混浊（后发障，posterior capsule opacification，PCO）发病率高，影响视力。在研究PCO的形成机制中，人们发现PCO是因残留的HLEC增生、迁移、分化、合成分泌细胞外基质，并逐渐纤维化，导致后囊膜增殖性改变，以及术后创伤和炎症反应而形成的。IL-1β是一种单核因子，能诱导晶状体上皮细胞的生物反应 ［1］ 。具有广泛的免疫调节作用，并有致热和介导炎症的作用，它的生物学功能是通过与相应高亲和力受体结合而介导的。经实验研究表明，IL-1β在白内障术后早期房水中的含量明显增高，有促进晶状体上皮细胞增殖和分化的作用 ［2］ 。NO是一种自由基性质的气体，易溶于水和脂肪，可在细胞内外自由弥散，在生物体内可作为介质、信使或细胞功能调节因子而参与机体的许多生物活动和病理过程。诱导型一氧化氮合酶（inducible NO synthase，iNOS）是体内催化NO合成的酶。人的视网膜、葡萄膜、睫状肌和房水通道中有iNOS的分布 ［3］ 。有报道认为，IL-1β可能是iNOS的诱导剂，但有关IL-1β诱导的iNOS在晶状体的表达情况却鲜有报道。本文旨在探讨NO和iNOS在IL-1β诱导的PCO形成中的作用，为进一步阐明PCO的发病机制提供可能的相关线索。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要仪器 CO 2 培养箱（NAPCO5410）;超净工作台（苏州净化设备厂）;倒置相差显微镜（OLYM-PUS IMT-2）;超声波细胞破碎机（德国dr.hielscher UO2000H）;低温离心机（HERMLEZ283K）。 　　1.2 主要试剂 DMEM培养基，小牛血清（GIB-CO公司）;IL-1β（Sigma公司）;iNOS试剂盒（南京建成生物工程研究所）;MTT试剂（美国Fluka）;Griess试剂（Promega公司）; 　　1.3 方法 　　1.3.1 HLEC HLEC以含10%胎牛血清（FBS）与100mg/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养液培养及传代，以1×10 5 /ml的密度接种于培养皿中，细胞80%以上融合后，换无血清DMEM培养用于实验。 　　1.3.2 MTT实验 借助酶标仪测定反映增殖作用大小的光密度（OD）值:将细胞消化后调整细胞浓度，将100μl晶体上皮细胞以1×10 5 /ml的密度接种于96孔培养板中，加入0.00002，0.0002，0.002，0.02，0.2和2ng/ml的IL-1β100μl，在37℃孵育24h后，弃上清，PBS冲洗两遍，每孔加入100μl MTT溶液（5g/L），继续孵育4h，每孔加100μl二甲基亚砜，振荡10min后，用酶标仪于570nm处测定OD值。以不加入IL-1β的作为对照。 　　1.3.3 NO水平的测定 根据Griess反应原理，测定细胞培养上清液中NO水平:培养上清液经离心后取100μl加入等量的Griess反应液（1%磺胺、0.1%N-1-萘乙二胺）混匀，室温放置10min，用酶标仪于540nm处进行光密度测定，根据标准曲线换算为NO浓度。 　　1.3.4 iNOS活性的检测 按照试剂盒操作方法进行检测，取上清液，加入反应底物:L 2 精氨酸，辅酶，NADPH等和呈色剂振荡，因iNOS催化L 2 精氨酸生成NO，而NO与二价铁配合物（呈色剂）形成有色物，在540nm波长处测定其消光值大小，即代表iNOS活性。 　　1.3.5 统计学分析 采用单因素方差分析进行组间比较，所有结果均经过3次以上重复实验。 　 　　2 结果 　　2.1 IL-1β对HLEC增殖作用的影响 与对照组比较，除2ng/L组外，其余浓度为0.00002～0.2ng/L的IL-1β增殖效应均明显大于对照组（Plt;0.05），结果见表1。 　　表1 IL-1β对HLEC增殖作用的影响（略）　　注:0ng/L为对照组，与0ng/L比较，1）Plt;0.05，n=4 　　2.2 IL-1β对晶体细胞NO水平及iNOS活性的影响 对照组和0.00002ng/L IL-1β组NO水平较低，用本研究中实验方法未检测出，晶体细胞内的iN-OS水平在0.0002ng/L组开始增高，0.2ng/L组达最高水平，与对照组相比差异显著（Plt;0.05）（表2）。 　　表2 IL-1β对HLEC内NO含量和iNOS活性的影响（略） 　　注:0ng/L为