TNFR1-RANK嵌合体构建及其在探究破骨细胞分化中意义.doc

TNFR1/RANK嵌合体构建及其在探究破骨细胞分化中意义 　 作者：许多荣， 罗绍凯 ， 童秀珍， 李娟 【摘要】 【目的】 构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)膜外部分和核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）跨膜及膜内部分相结合的嵌合体，探讨其在破骨细胞(OC)分化中的意义。【方法】 克隆TNFR1/RANK嵌合体的cDNA，用plat E将其包装成逆转录病毒，通过感染将这种逆转录病毒转染到敲除TNFR1/R2基因的小鼠(TNFR1-/R2-)骨髓巨噬细胞(BMM)中；用TNFɑ刺激，分别观察OC的分化及骨的重吸收能力；用Western Blot方法证实TNFR1/RANK是通过NF-?资B、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能。【结果】 在TNFɑ刺激下，BMM能分化成OC，而且分化出的OC能明显地导致骨质破坏。TNFɑ刺激BMM 5 min后磷酸化的NF-?资B、JNK、P38和ERK蛋白的表达明显增强。【结论】 TNFR1/RANK嵌合体具有完整的分子结构和生物功能，可作为研究RANK结构、功能及其信号途径的一个简便、有效的生物工具。 【关键词】 TNFR1/RANK; 嵌合体； 破骨细胞； 分化； 克隆 破骨细胞(osteoclast, OC)的分化受两个重要细胞因子的调节：单核/巨噬细胞集落刺激因子(monocyte/macrophage-clone stimulating factor，M-CSF)和核转录因子NF-κB受体激动剂的配体（ligand of receptor activator of nuclear factor kappa B, RANKL）。M-CSF主要维持OC的生长，RANKL则促进OC的定向分化[1-3]。RANKL必须与其受体RANK结合，再通过NF-?资B、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能[4]，所以RANK是起作用的关键环节。正常的骨髓巨噬细胞(BMM)中存在内源性RANK，但很难直接在机体活细胞内研究其结构和功能。为了克服这一难题，我们成功地构建了一种新的肿瘤坏死因子受体1/核转录因子NF-κB受体激动剂(tumor necrosis factor receptor 1/receptor activator of nuclear factor kappa B,TNFR1/RANK)嵌合体(chimera)，其膜外部分由TNFR1膜外部分组成、膜内部分由RANK跨膜和膜内部分组成，它具有完整的分子结构和生物功能，完全可以替代内源性RANK的作用，现报道如下。 1 材料和方法 1.1 材料 野生型C3h小鼠购于美国Harlan Industriy in Indianapolis，肿瘤坏死因子受体基因敲除小鼠（TNFR1-/-R2-/-）购于美国the Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)；质粒pBluescript SK+、质粒PMX-puro、包装细胞Plat E、M-CSF、GST-RANKL:由美国阿拉巴马大学伯明翰分校(University of Alabama at Birmingham)病理实验室Xu Feng教授提供；抗体IκB-α、Phospho-IκB-α、SAPK/JNK、Phospho-SPAK/JNK、P38 MAP Kinase、Phospho- P38 MAP Kinase、P44/42 MAP kinase、Phospho- P44/42 MAP kinase及磷酸酶抑制剂Ⅰ和磷酸酶抑制剂Ⅱ购于美国Cell Signaling公司。用于扩增TNFR1膜外部分（TNFR1-Ext）的cDNA引物序列为(美国Sigma公司合成)：P1:5′-TCTAGAATGGGTCTCCCCACC GTGCCTGGCCTGCTG-3′；P2:5′-TCTAGAACCT GAGTCCTGGGGGTTTGTGACATTTGC-3′（两端酶切位点均为Xba-Ⅰ）。用于扩增 RANK跨膜、膜内部分(RANK-TM/RANK-Cyt) cDNA引物序列为：P1:5′-TCTAGAATGGGTCTCCCCACCGTGCCTGG CCTGCTG-3′；P2:5′-TCTAGAACCTGAGTCCTGGG GGTT TGTGACATTTGC-3′（P1的5′含Spe-Ⅰ；P2的5′含BamH、stop code和mLu-1）。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 CH3小鼠、TNFR1-/-R2-/-小鼠的BMM和包装细胞Plat E培养参考[5]。 1.2.2 质粒PMX-TNFR1/RANK的克隆 TNFR1/RANK主要由两个部分组成：TNFR1膜外部分（TNFR1-Ext）、RANK跨