MCI186减轻Aβ140诱导PC12细胞tau蛋白磷酸化探究.doc

MCI186减轻Aβ140诱导PC12细胞tau蛋白磷酸化探究 　【摘要】 目的 探讨依达拉奉(MCI186)对β样淀粉蛋白(Aβ140)引起的PC12细胞tau蛋白磷酸化的保护作用及其机制。方法 采用 Western 印迹等检测Ser396，Ser199/202，Tau5及GSK3β，GSK3βSer9磷酸化水平,观察MCI186对Aβ2535致PC12细胞的损伤保护作用。结果 模型组 tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平及总tau蛋白水平在Aβ140作用3 h后开始升高，同时GSK3β的表达增多，磷酸化GSK3βSer9的表达减少，MCI186保护组tau蛋白在Ser396，Ser199/202位点的磷酸化水平和总tau蛋白水平均明显低于Aβ模型组(Plt;0.05)，GSK3β的表达减少，磷酸化GSK3βSer9的表达增多(Plt;0.05)。结论 在Aβ140诱导PC12细胞损伤过程中，出现了tau蛋白的过度磷酸化，可以使Ser396，Ser199/202位点及Tau5蛋白升高。激活GSK3β是产生tau蛋白过度磷酸化的主要途径。MCI186可通过抑制GSK3β的活性，从而减轻Aβ140诱导的tau蛋白过度磷酸化，而达到保护神经细胞的目的。 【关键词】 依达拉奉;阿尔茨海默病;糖原合成酶激酶3;tau蛋白磷酸化 AD是常见的中枢神经系统退行性疾病，在众多的发病机制中，更多的学者倾向于其核心改变是tau蛋白过度磷酸化。目前临床上用来治疗AD的药物均只能改善轻中度患者的部分症状，不能减轻脑内的病理改变，阻止病情的进展，对tau蛋白的过度磷酸化没有逆转作用。依达拉奉(MCI186)是一种自由基清除剂，可以特异性清除羟自由基(OH)，抑制氧化应激及其继发的细胞凋亡，发挥神经保护作用，主要应用于脑梗死的早期和脑出血的治疗。临床发现依达拉奉对部分痴呆患者有改善症状的作用，从而提示其可能是一种具有前途的治疗AD的药物。本研究旨在探讨依达拉奉对tau蛋白过度磷酸化是否有逆转作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 药品与试剂 PC12细胞购自中国生命科学院上海细胞所，Aβ140、兔抗鼠IgG购自北京鼎国生物公司，Tau〔PS396〕多克隆抗体、Tau〔PS199/202〕多克隆抗体购自Biosource公司，Tau5单克隆抗体购自BD Pharmingen公司，Protein Marker购自美国Biolabs公司，DAB显色试剂盒购自博士德公司,依达拉奉购自江苏先声药业有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养和预处理 用含有15%胎牛血清的DMEM培养基(3.7 g NaHCO3)，置于37℃，5% CO2孵箱中培养，每3天传代1次，传代时用机械方法吹打贴壁的PC12细胞，取生长期细胞用于实验。 　　1.2.2 实验分组 　　1.2.2.1 Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白磷酸化 将30 μmol/L Aβ140作用于PC12细胞，分别作用0，3，6，12，24，36 h后提取蛋白检测Tau〔PS396〕、Tau〔PS199/202〕及Tau5磷酸化水平。 　　1.2.2.2 LiCl对Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白磷酸化的影响 实验分为3组：(1)对照组：正常PC12细胞;(2)模型组：加入浓度为30 μmol/L Aβ140作用于PC12细胞12 h;(3)LiCl处理组：加入浓度为10 mmol/L LiCl与30 μmol/L Aβ140共同作用于PC12细胞12 h;检测Tau〔PS396〕，Tau〔PS199/202〕，Tau5及GSK3β，GSK3βSer9磷酸化水平。 　　1.2.2.3 MCI186对Aβ140诱导分化PC12细胞tau蛋白过度磷酸化的影响 分3组：(1)对照组：不加任何处理因素;(2)模型组：加入浓度为30 μmol/L Aβ2535作用于PC12细胞12 h;(3)保护组：将20 μmol/L MCI186处理PC12细胞2 h后与30 μmol/L Aβ140共同作用于PC12细胞12 h;分别检测Tau〔PS396〕、Tau〔PS199/202〕、tau5及GSK3β，GSK3βser9磷酸化水平。 　　1.2.3 蛋白免疫印迹法(Western印迹法) 常规蛋白质提取; 采用Bradford(1976)法进行蛋白质定量。一抗为Tau〔PS396〕多克隆抗体、Tau〔PS199/202〕多克隆抗体、Tau5单克隆抗体、GSK3β、GSK3βser9抗体，二抗为兔抗鼠IgG。 　　1.3 统计学分析 所有数据均采用x±s表示，采用SPSS13.0