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Med19基因沉默对胃癌细胞增殖及细胞周期影响 　 作者：丁相福 李俊安 宋彬 房学东 【摘要】 目的 研究Med19基因在胃癌MGC803细胞中沉默后对细胞增殖和周期的影响。方法 应用shRNA慢病毒载体感染胃癌MGC803细胞沉默Med19基因，通过MTT和克隆形成实验观察Med19基因在胃癌细胞增殖中的作用，并用流式细胞术验证抑制Med19基因对细胞周期的影响。结果 构建的shRNA慢病毒载体感染MGC803细胞后细胞增殖能力显著降低、细胞克隆形成能力明显减弱，同时，细胞周期阻滞于G1期。结论 Med19基因沉默后胃癌细胞的增殖能力和细胞周期均受到显著影响，提示Med19在肿瘤形成过程中具有重要作用。 【关键词】 胃癌;Med19;RNAi;增殖;细胞周期 中介体(Mediator)最早发现于酵母菌中，是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子复合物，属于RNA 聚合酶Ⅱ通用转录装置的基本组分，在真核生物mRNA 合成的活化和抑制中发挥关键作用，对RNA聚合酶Ⅱ活力进行调节〔1～3〕。哺乳动物中介体的亚基组成及其相关活性已经确定，目前已鉴定30余种亚基，其中多数亚基与酵母的中介体亚基存在广泛的同源性〔4，5〕。Med19是中介体其中一个亚单位，又称为肺癌转移相关蛋白(lung cancer metastasis related protein l, LCMR1)。最初由高转移肺癌中克隆得到，已被证实参与细胞信号由胞外向胞内转导。抑制Med19基因，可引起某些调节细胞生长、细胞分化和凋亡的基因的表达发生改变，提示Med19可能参与细胞周期调控、信号转导或转录调控〔6〕。本研究利用慢病毒介导的RNAi方法在胃癌MGC803细胞中沉默Med19基因，观察其影响细胞增殖和细胞周期的能力，从而对Med19基因在胃癌中的功能进行验证。 　　1 材料与方法 　　1.1 Med19基因shRNA 慢病毒载体的构建 靶向Med19基因的siRNA序列3′AAGGTGAAGGAGAAGCTAAGT5′，由上海生工公司合成短发卡结构的双链DNA(shRNA)，重组进入慢病毒质粒pLVTHM，转化大肠杆菌感受态细胞并挑选重组克隆进行菌落PCR鉴定，测序验证后的shRNA慢病毒载体大量扩增，与包装辅助质粒psPAX2、pMD2G共转染至病毒包装细胞293T，12 h后换液，转染72 h收集细胞上清，并裂解细胞，用微孔滤膜过滤除菌，超速离心后弃上清液，用冰PBS溶液重悬病毒沉淀，得到shRNA慢病毒包装颗粒，有限稀释法通过荧光观察标定病毒滴度。 　　1.2 慢病毒介导RNAi沉默Med19基因的效率验证 pLVTHMsiMed19载体包装的慢病毒颗粒感染胃癌MGC803细胞，72 h后荧光显微镜下观察GFP的表达情况，通过计算在白光下细胞总数与绿色荧光细胞的比值，得到GFP的阳性表达率，可知慢病毒对MGC803细胞感染率达到85%以上。感染后的第5天抽提细胞总RNA，通过RTPCR法检测shRNA慢病毒对Med19 mRNA表达的抑制作用;同时裂解细胞收集总蛋白，Western印迹法验证Med19蛋白水平表达的变化，确认shRNA慢病毒对Med19基因的阻断效应。 　　1.3 MTT方法检测细胞增殖情况 实验共分为三组：shRNA慢病毒感染组(shRNA组，靶向Med19基因的shRNA慢病毒)、非特异性的shRNA阴性对照病毒感染组(NC组，对照序列shRNA慢病毒)和空白对照组(C组，MGC803细胞未作任何处理)。取对数生长期细胞MGC803细胞接种于96孔板中，计数细胞每孔2 000个，每组5个复孔，接种5块复板。接种第2天加MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，4 h后吸出培养基，加入DMSO 100 μl/孔。5 min后酶标仪检测OD570吸光度值，连续检测5 d。每天一块复板。根据MTT读值绘制细胞生长曲线。 　　1.4 细胞克隆形成实验 实验分组同前，shRNA慢病毒感染后的MGC803细胞制备成细胞悬液，接种于6孔板，每孔200个细胞，将接种好的细胞于37℃、5% CO2培养箱中继续培养到绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途进行数次换液并进行细胞状态观察，连续观察14 d。实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，终止时用PBS溶液洗涤细胞2次，多聚甲醛固定细胞40 min，PBS溶液再次洗涤后用GIEMSA染色液对细胞染色10 min，去离子水清洗细胞3次去除背景，晾干、拍照和计数克隆。 　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期 实验分组同前，感染shRNA慢病毒的MGC803细胞接种于6孔板中，细胞固定时先用胰酶消化，待细胞呈圆形未脱落时，完全培养基终止，4℃预冷的PBS洗涤细胞沉淀2次，2 000