三氧化二砷对MRL-lpr狼疮鼠基因甲基化影响.docVIP

三氧化二砷对MRL/lpr狼疮鼠基因甲基化影响 　 作者：周艳 孙莉 陈丹 朱小春 【关键词】 三氧化二砷 MRL/lpr 狼疮鼠基因 甲基化 　　系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是最常见、最严重的自身免疫性疾病之一，重症狼疮的治疗效果目前仍不理想，因此，国内外学者都在寻求新的有效药物和新的治疗方法。三氧化二砷在临床上应用于白血病治疗已有多年，并有明显疗效。近年来有将三氧化二砷(ATO)用于狼疮鼠的治疗，取得了一定的疗效［１～３］。本研究应用动物实验观察ATO对SLE模型自身免疫及基因甲基化的影响，旨在探讨ATO在红斑狼疮中的治疗价值及其作用机制。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验动物的分组及处理 12周龄MRL/lpr小鼠24只(购自中国科学院上海实验动物中心，雌雄各半)，随机分为ATO组和生理盐水(NS)组，各12只，ATO组隔日腹腔注射ATO0.4 mg·kg-1·d-1，NS组隔日腹腔注射生理盐水，疗程60d。另将20只12周龄C57雄鼠随机分为ATO组和NS组，各10只，处理同上。 　　1.2 试剂、材料 三氧化二砷、鲑鱼精DNA及碱基标准品［腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(5mC)及胸腺嘧啶(T)］购自Sigma公司，HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中山生物科技公司，基因组DNA抽提试剂盒购自碧云天生物技术研究所，96孔酶标板购自Costar公司。 　　1.3 检测项目及方法 (1)抗dsDNA抗体水平测定［４］：ELISA方法测定用鲑鱼精DNA包被96孔酶标板，待测血清均作1:100稀释，结果在酶联免疫检测仪450nm处读出OD值。(2)DNA甲基化水平测定：DNA抽提及水解：使用试剂盒对各样品进行提取和纯化DNA，将约100μg基因组DNA和100μL氢氟酸混匀, 80℃水温育12h，然后于40℃烘箱至液体完全蒸发，随后加入0.02 mol/L，pH 2.3的NH4H2PO4 100μL；色谱条件及甲基化水平测定：Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱：25cm×4.6mm，5μm，Hypersil ODS C18反相色谱柱，柱温为20℃，以0.02 mol/L、pH2.3的NH4H2PO4为流动相，流速为1.2ml/min，检测波长为280nm，进样量为20μl，先用流动相平衡色谱柱至基线平稳，开始将5种碱基标准品：(A、G、C、5mC、T)分别进样，工作站软件处理后得出峰形和每种标准品的持留时间，即可确定各种碱基流出顺序，再将样品逐个进样，得出峰形和数据后根据C和5mC的峰下面积按公式DNA甲基化水平(%) = 5mC/(5mC+C)×100 %，求得DNA甲基化水平。(3)血常规测定：应用SYSMEX KX21对各组小鼠外周血进行检测。 　　1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，资料用(x±s)表示，两样本均数比较采用t检验。以P＜0.05为差异有显著性。 　　2 结果 　　2.1 MRL/lpr小鼠治疗前后抗dsDNA抗体水平的变化 在给药前ATO组和NS组的抗dsDNA抗体水平并无明显差异。治疗后ATO组小鼠的抗dsDNA抗体水平较NS组明显降低(Plt;0.01)。见表1。 　　表1 ATO对MRL/lpr小鼠治疗前后抗dsDNA抗体的影响（略） 　　注：与给药前比较，*Plt;0.01；与NS组比较，△Plt;0.01 　　2.2 治疗后两组MRL/lpr小鼠各脏器重量比较 实验结束时称取脾脏、胸腺、两侧腋窝及颈部淋巴结的重量。ATO组脾脏的重量较NS组明显减轻(Plt;0.05)。ATO组总淋巴结的重量较NS组也明显减轻(Plt;0.05)，而胸腺重量两组未见明显差异。见图1。 　　2.3 治疗后两组MRL/lpr小鼠DNA甲基化水平的比较 图2、3分别为ATO组和NS组小鼠脾脏DNA裂解后的高效液相图谱，图中基线平稳，可见清晰的5个吸收峰，按流出顺序分别为C、5mC、G、T、A。结果显示，ATO组脾脏DNA甲基化水平(3.78±0.81)%，NS组(2.16±0.42)%；ATO组淋巴结DNA甲基化水平(2.38±0.54)%，NS组(1.71±0.24)%，ATO组脾脏及淋巴结的DNA甲基化水平较NS组有明显的升高(Plt;0.05)，而血液与胸腺的甲基化水平两组相差不大(Pgt;0.05)，见图4。 　　2.4 治疗后MRL/lpr、C57小鼠外周血细胞计数比较 在实验结束时测定四组小鼠的血常规，结果显示ATO治疗后MRL/lpr及C57小鼠的红细胞、白细胞、血红蛋白与NS组相比并无明显差异，而MRL/lpr小鼠ATO组血小板较NS组有明显升高(Plt;0.05)，见表2。 　　表2