急性冠脉综合征患者CD4+CD28-T淋巴细胞及HLADRB1相关性.docVIP

急性冠脉综合征患者CD4+CD28-T淋巴细胞及HLADRB1相关性 　 作者：黄立娟, 李璐璐, 宋辉, 杜波 【摘要】 目的: 探讨人 HLADRB1等位基因多态性与急性冠脉综合征（ACS）CD4+CD28- T细胞数量的关系。方法: 采用聚合酶链反应序列特异性引物DNA分型技术对136例ACS患者和115例健康对照进行HLADRB1基因分型。同时采用流式细胞术（FCM）进行CD4+CD28- T 细胞测定, 分析HLA与CD4+CD28- T 细胞的相关性。结果: HLA DRB1*15, DRB1*04和DRB1*01等位基因与CD4+CD28- T淋巴细胞数量相关, 表达DRB1*04和DRB1*01的患者有高百分比的CD4+CD28-T淋巴细胞, 而表达DRB1*15的所有患者却有低数量的CD4+CD28- T淋巴细胞。结论: 在黑龙江地区人群中, ACS患者CD4+CD28- T细胞的形成与HLADRB1*01、 DRB1*04和DRB1*15 密切相关。 【关键词】 急性冠脉综合征; CD4+CD28- T淋巴细胞; 人白细胞抗原 大量文献研究表明免疫与炎症参与了动脉粥样硬化的形成及发展, 尤其是T细胞免疫在冠心病发生发展中的作用已成为目前研究的热点。研究发现急性冠脉综合征ACS患者外周血出现CD4+CD28- T细胞增多的现象, 推测这种细胞的出现可能是受遗传控制的［1］。此前研究还发现在类风湿性关节炎患者CD4+CD28- T细胞的出现与HLADR等位基因相关联［1］。因此可以这样设想ACS患者中的CD4+CD28- T细胞增多可能与HLA有关。 1 材料和方法 1.1 材料 PCRSSP分型试剂盒（中国医学科学院基础所）; PCR扩增仪（美国BioRad公司, My CyclerTM）; 电泳系统 （美国BioRad公司, MiniProteinII电泳系统）; 凝胶成像系统（上海天能科技有限公司, GIS）; 流式细胞仪( 美国BD公司)、 PerCPCD3单克隆抗体（mAb）, FITCCD mAb, PECD28 mAb, PE鼠IgG1, PerCP鼠IgG1, FITC鼠IgG1和10×FACS溶血素（美国BD公司）; PBS和10 g/L多聚甲醛为实验室自行配制。所有标本均来自哈尔滨医科大学附属第二医院住院患者。分组（1）ACS组: 136例, 男72例, 女64例; 平均年龄52.3±13.1岁。ACS的诊断符合1979年国际心脏病学会和协会及世界卫生组织(ISFC/WHO)的诊断标准。（2）对照组: 115名同地区无血缘关系健康人, 男60名, 女55名, 年龄38～55岁, 无冠状动脉疾病病史。所有标本用50 g/L EDTA抗凝管抽取清晨空腹静脉血3～5 mL, -20℃冻存备用。 1.2 方法 1.2.1 基因组DNA制备 参考《分子克隆实验指南》（第3版）: 哺乳动物DNA的快速分离。 1.2.2 PCRSSP法进行HLADR分型 （1）取已消毒的0.5 mL Eppendorf离心管, 依次标记DRB1DRB10、 DRB51DRB53共17管和DQB1*0201DQB1*0604共10管, 在25 μL/管的反应体系中, 依次加入下列各组分: ①引物4 μL。②扩增反应液20 μL（含dNTP, 内对照, 缓冲液, Taq酶5单位）。③待检DNA（0.05～0.1) g/L 1 μL。（2）混匀反应体系, 1 000 r/min离心30 s。（3） PCR扩增 : 94℃预变性120 s, 然后按如下程序扩增: 94℃变性40 s, 54℃退火45 s, 72℃延伸40 s, 循环30次。再于72℃延伸300 s。所有扩增均在美国BioRad公司扩增仪上进行。 1.2.3 扩增产物的检测 取扩增产物5 μL, 与1 μL上样缓冲液混匀后, 加样于20 g/L的琼脂糖凝胶中, 水平电泳检测, 在美国BioRad公司电泳仪及配套电泳槽上电泳, 电压100 V, 约20 min。于全自动凝胶成像分析系统记录结果进行分析。 1.2.4 CD4+CD28- T细胞频率测定 （1）实验设实试管和对照管。试验管和对照管分别加入新鲜全血100 μL。（2）实验管加入20 μL CD3PerCP mAb, PECD4 mAb和FITC CD28 mAb, 对照管加入20 μL PE鼠IgG1、 PerCP鼠IgG1和FITC鼠IgG1, 混匀, 室温避光孵育30 min。加入红细胞裂解液裂解红细胞, 离心5 min弃上清。（3）PBS洗涤。1 000