一株高效氧化胆固醇的简单节杆菌构建与转化条件优化.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（１１）：７０７５ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 一株高效氧化胆固醇的简单节杆菌 构建与转化条件优化 张　瞡　张玉富　秦慧民　毛淑红　路福平 （天津科技大学生物工程学院　工业发酵微生物教育部重点实验室　天津　３００４５７） 摘要　为实现胆固醇的高效生物氧化，利用基因工程手段将编码简单节杆菌胆固醇氧化酶的 ＤＮＡ片段克隆到质粒ｐＴＹ２中，构建ｐＴＹ２５３３２插入表达载体。该载体以简单节杆菌基因组中的 １６ＳｒＤＮＡ位点为整合点，提高了胆固醇氧化酶在基因组中的拷贝数，实现了简单节杆菌胆固醇氧 化酶的过表达。重组菌的生长实验分析表明，插入到１６ＳｒＤＮＡ位点的胆固醇氧化酶没有影响简 单节杆菌的生长。重组菌可在２０ｈ将２ｇ／Ｌ的胆固醇完全转化为４胆甾烯３酮，比原始菌的转化 时间缩短了４ｈ，提高了胆固醇的转化效率。经过转化条件优化确定了该重组菌以２％的接种量后 继续培养１６ｈ，然后胆固醇经１２０目过筛后投料量为２ｇ／Ｌ，并添加２％（体积比）二甲基甲酰胺作 为促溶剂；胆固醇添加１８ｈ后可完全转化为４胆甾烯３酮，是优化前的１．１１倍。 关键词　简单节杆菌　胆固醇氧化酶　胆固醇　４胆甾烯３酮　１６ＳｒＤＮＡ 中图分类号　Ｑ７８ 　　胆固醇（５胆甾烯３醇，ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）又称为胆甾 反应液中添加有机试剂，使其组成双相系统来提高其 β ［８９］ 醇，化学式为ＣＨ Ｏ，属于类固醇，是一种重要的甾体 转化率 ，虽然这些方法可以使４胆甾烯３酮的转化 ２７ ４６ 化合物，它在微生物的作用下可以转化成４胆甾烯３ 率有一定的提高，但其生产成本也会进一步增加。 酮。４胆甾烯３酮（４ｃｈｏｌｅｓｔｅｎ３ｏｎｅ）又称为胆甾烯 ［１０］ 　　随着简单节杆菌的全基因组测序的完善 ，其中 酮，化学式为Ｃ Ｈ Ｏ，可作为减肥食品添加剂或抗高 的胆固醇氧化酶序列也已公布。本研究利用分子生物 ２７ ４４ 脂血症药物抑制人体内脂肪的积累，用以防止发生肥 学的方法克隆胆固醇氧化酶基因，以简单节杆菌的 ［１］ 胖及相应的一些症状 。此外，４胆甾烯３酮也是合 １６ＳｒＤＮＡ作为整合位点，使整合后的基因都以多拷贝形 成一些药物激素的重要原料或中间体［２］。 式存在于基因组，从而实现简单节杆菌胆固醇氧化酶基 　　利用生物转化法氧化胆固醇，具有绿色环保、低能 因ｃｈｏ的多拷贝过表达，构建可以氧化胆固醇生产４胆 ［３－４］ 甾烯３酮且基因型较稳定的重组菌株。此外，本研究针 耗等特点 。近年来，通过微生物的生物转化对甾体 化合物进行脱氢、羟化及侧链切割等反应而获得一系 对胆固醇在水中溶解度低，还对胆固醇投料量、颗粒度及 ［５－７］ 不同促溶剂对胆固醇的转化影响等参数进行了优化。 列价值高昂的药物制剂或药物中间体 。 　　简单节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）是一株重要的工 １　材料与方法 业菌种，可以对甾体化合物进行高效的１、２位脱氢，同 时也可利用细胞内的胆固醇氧化酶（ＥＣ１．１．３．６）将胆 １．１　材　料 固醇转化为４胆甾烯３酮。目前，对于４胆甾烯３酮 １．１．