Ghrelin对胰岛β细胞脂性凋亡影响及其分子机制实验的研究.pdfVIP

分光光度计在405nlll波长测定其吸光值。 4、TUNEL法检测细胞凋亡 凋亡检测方法参照TUNEL原位末端POD标记检测试剂盒说明书进行，细胞 爬片长至80％覆盖率后，进行实验处理。加入lmL的4％甲醛溶液，4C固定细胞 10 onverter-horse．radish 染。光学显微镜下计数细胞凋亡。凋亡的细胞核呈现棕褐色或黑色；正常的细胞 100％。 核用苏木素复染成蓝核。凋亡率-(凋亡细胞／全部细胞)x 5、Hoechst33258染色 min， 细胞爬片放置在6孔板中，加入1mL的4％甲醛溶液，4C固定细胞10 Hoechst 弃去固定液，PBS洗二次，滴加100p,L33258(10ug／mL)T作液，室温染 色10min，流水冲净，于340nm波长的荧光显微镜下观察并计数细胞凋亡。凋 亡细胞核染色质聚集或核碎裂。凋亡率=(凋亡细胞／全部细胞)x100％ 6、AnnexinV-PI双染，流式细胞仪分析 收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5万重悬的细胞，10009离心 Annexin 5min，弃上清，加入195弘L V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5此 Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10此碘化丙啶 弃上清，加入190pLAnnexin VoFITC为绿色荧光， (PI)染色液，轻轻混匀，随即进行流式细胞仪检测，Annexin PI为红色荧光。 7、电镜 MIN6细胞在250mL培养瓶中长至80％，进行实验处理后，用2．5％戊二醛 固定后收集细胞，制作电镜标本，进行观察。 8、特殊染色法测细胞内甘油三脂含量 应用甘油三酯检测试剂盒(GPO．POD)澳U定MIN6细胞胞浆甘油三脂含量。收 集细胞，PBS冲洗两遍后在超声下裂解。将10uL细胞裂解物或标准品移入96 孔板。每孔加入200uL甘油激酶，70uL磷酸甘油氧化酶和显影剂。酶标仪500nm 波长下测定吸光度值。绘制标准曲线，通过标准曲线计算胞浆甘油三酯含量。 9、细胞总RNA的提取及RT-PCR检测 成eDNA。使用Primer5软件设计引物，送试剂公司合成。PCR扩增目的基因， 在1．5％琼脂糖凝胶电泳分离形成目的条带，溴化乙锭染色成像；测定电泳条带 密度值；扫描成像用Scion Image软件分析灰度值。 10、Western blot(免疫印记) 应用细胞裂解液提取细胞蛋白，测定蛋白浓度。制备10％聚丙烯酰胺凝胶， 的上样量为50ug。ECL发光法测定目的条带，目的条带的灰度值用ScionImage 软件分析。 1l、统计学分析 应用SPSS 13．0软件进行单因素方差(ANOVA)统计分析，结果用均数4-标准 差(祜曲表示，组间差异比较采用Dunnett。S检验，P0．05差异有显著性。 实验结果 一、脂毒性对胰岛p细胞的细胞活性、微观结构和诱导细胞凋亡的影 响研究 1、棕榈酸产生的脂毒性能够浓度依赖性地降低胰岛D细胞的细胞活性。 染色质凝聚，内 2、棕榈酸的毒性使胰岛D细胞形态严重受损(电镜)，核皱缩， 质网扩张，线粒体肿胀，胞浆中的分泌颗粒减少或消失。 3、棕榈酸能够浓度依赖性地诱导胰岛p细胞凋亡。 二、Ghrelin对胰岛B细胞脂性凋亡和甘油三酯沉积的影响 1、应用MTT法检测细胞活性的结果显示，0．4mM棕榈酸干预胰岛p细胞24h明显 脂毒性的功效，100riM ghrelin的作用最强，可以显著提高细胞活性达34％