生物化学实验-2014生化实验报告ok.docVIP

大连理工大学生命科学与 生物化学实验报告 年 ：生 姓 名：夏康凯 学 号： 2014年6月24日 实验 3, 5 -二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖 1、实验目的： 掌握比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 2、实验原理： NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 3、实验步骤： 1. 取6个试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水 2. 向各试管中分别加入DNS试剂1 ml，充分混合，放入沸水浴中加热煮沸2 min进行显色，取出试管放入盛有冷水的烧杯中迅速冷却。 3.向各管中分别加入8 ml蒸馏水，充分混合。 4.以空白管（0号管）做对照，于540nm 波长下调0，然后测定各管的OD?值。 5.以光吸收值作为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。如果该直线不通过零点，必须重做。 管号 葡萄糖标准液（ml） 蒸馏水（ml） 最终浓度（mg/ml） OD540nm 0 0.0 1.0 0.0 0 1 0.2 0.8 0.2 0.3325 2 0.4 0.6 0.4 0.6955 3 0.6 0.4 0.6 1.0091 4 0.8 0.2 0.8 1.3457 5 1.0 0.0 1.0 1.6855 （二）还原糖的制备 1. 称取2g玉米粉，把它放入一个100ml的三角瓶中，然后加入20~30ml蒸馏水，搅拌均匀。 2. 把三角瓶放于一个50℃水浴中保温 30 min，不时搅拌。 3. 拿出三角瓶，将三角瓶内含物转入50ml的容量瓶中：过滤，定溶，充分混合，滤出液即为还原糖提取液。 (三) 样品总糖的水解和提取 1. 取1g玉米粉，放在100ml三角瓶中，加15ml水溶解，再加10ml 6mol/L 盐酸，混匀。 2. 将三角瓶置于沸水浴中加热煮沸30 min。 3.取出1~2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。 4.拿出三角瓶，冷却，过滤，滤出液即为总糖提取液。 5.加入3-5滴酚酞指示剂，混匀，用6mol/L的NaOH中和至溶液呈微红色。将中和后的溶液转入100 ml的容量瓶中定容。 （四）样品中含糖量的测定 1. 取5支试管，编号，按下表向每支试管中加入试剂。 2. 用管1做对照，测定每管在540nm下的OD值。将结果记录在表中。 试???? 剂 管?????????? 号 1 2 3 4 5 还原糖抽提液（ml） 0.0 0.5 0.5 0.0 0.0 总糖抽提液（ml） 0.0 0.0 0.0 0.5 0.5 DNS（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 加热 在沸水浴中加热2分钟，然后冷却之。 蒸馏水（ml） 4.5 4.0 4.0 4.0 4.0 OD540 0 0.2271 0.2299 0.4723（稀释五倍） 0.4983（稀释五倍） 3. 根据还原糖和总糖的OD值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计算还原糖和总糖的百分含量，即： 还原糖％= （从曲线中查出的还原糖的浓度×N ×V/样品重）×100% 总糖％= （从曲线中查出的总糖的浓度×N × V/样品重） ×100% ? ??N：稀释倍数； V：提取液体积 4、实验结果讨论： 问题1：3, 5二硝基水杨酸DNS）法测定时为什么要设空白？ DNS 问题2：费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法各有何优缺点？ 问题3： 在200-350nm工作的比色皿适用于紫外区，必须使用石英石英比色皿。石英比色皿既可用于紫外区又可用于可见区，而普通硅酸盐光学玻璃制成的透光面的比色皿，只能用于350ｎｍ至1000ｎｍ的可见区。 - 6 -