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TBDNAPCR阳性意义再认识 　【摘要】 TBDNAPCR阴阳性的判定标准与阳性意义的认识有不同的观点，本文拟对此结合作者自己的临床经验加以论述，与大家共同探讨。 【关键词】 TBDNAPCR；阳性；L型结核菌 　　 　　自1985年美国PECetus公司人类研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，其推广应用迅速普及全球。国内也在20世纪90年代普遍应用，在医学领域，特别是在传染病诊断中的应用已相当广泛。传统的结核病诊断方法有其不足之处：影像学缺乏统一标准，临床医生对同样的影像学资料可有不同的看法；实验室病原学涂片检查灵敏度太低，需每毫升标本含菌量在5 000条～10 000条以上才可检出，培养时间太长，一般需30 d左右，难以满足临床需要。PCR技术在结核病诊断中的应用弥补了其不足，具有快速、特异、灵敏度高的优点为临床广泛应用，但随之而来的假阳性与阳性结果的解释有待进一步探讨。因PCR技术在临床广泛应用中的假阳性(误诊)屡屡发生，给患者造成不应有的损失和伤害，为此，国家卫生部曾发文暂停PCR用于临床疾病诊断，并于2002年1月14日印发《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》—卫医发［2002］10号。其内容分为总则、实验室设置和验收、实验室监督和管理、附则、临床基因扩增实验室基本设置标准五个部分。规定以后的基因扩增实验室实行许可证制度。其必须具备相应的硬件与软件：仪器与试剂必须有相应的批准文号，实行准入制；实验室布局合理，人员须经培训合格，并向相关部门提出申请，经检查符合要求，取得合格证，方可开业用于疾病诊断。我们相信随之假阳性将会降低到最低程度。当TBDNAPCR排除了假阳性的阳性其意义又如何呢？理论上讲，当临床怀疑某一患者为结核患者，其标本中检测到TBDNA拷贝数，即出现一个拷贝数时，就可认定为阳性，但实际情况并不是这样。结核病的细菌学检查在结核病流行病学、诊断、治疗与疗效考核中有重要意义，而其方法的局限性难以满足结核病防治工作的需要。PCR弥补了其不足，但临床的阴阳性判定没有统一的标准。目前临床上TBDNAPCR有定性与定量之分。定性有一些缺点，定量克服了定性的许多不足，逐渐为大家所接受。定量PCR有广义和狭义概念之分。广义定量PCR技术是以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测进行PCR起始模板的定量。其中外标法+过程监测+内对照方法监测扩增效率，阳性标本定量准，同时排除假阴性结果。狭义定量PCR即严格意义的定量PCR技术，是指用外标法(荧光杂交探针保证特异性)通过监测PCR过程，监测扩增效率，达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果。在国家没有出台阴阳性判定标准时，所用PCR系统灵敏度最好达到一个拷贝数。只要检出一个拷贝数样本就称为阳性，一个拷贝数没有才算阴性。结核杆菌(抗酸杆菌)涂片检查灵敏度太低，培养理论上可检出一条菌，但实际受许多因素影响，并没有那么高，阳性率在30%以下。TBDNAPCR检出阳性率大部分报道在50%以上，在结核患者血液单核细胞中TBDNAPCR阳性率高达43.5%~86.6%［1］。相对于传统的病原学检查灵敏度提高了20%以上。分析其原因，主要是传统方法检查的是结核菌的一般性状，而实际许多结核患者体内存在的L型结核菌传统方法无法检出。菌阴肺结核患者占肺结核患者70%左右，其他型结核病多为菌阴结核病。有报道在菌阴肺结核患者标本中结核杆菌，L型阳性率在20.0%~29.4%［2］。为此，中华结核和呼吸杂志编辑委员会制定了结核分支杆菌L型的检测方法(试行)［3］。这也说明TBDNAPCR提高的阳性率其中大部分为L型结核菌，再有一部分为标本中因含菌量太少，传统方法无法检出。其次是TBDNAPCR检出的是结核菌的DNA，无论死活结核菌都可检出。涂片可检出死菌与活菌，但灵敏度太低，而培养只可检出活力相对旺盛的结核菌，低活力结核菌和死菌即可见而不可育结核菌培养则无法检出。故TBDNAPCR阳性可分为五部分。第一部分为传统方法涂片培养阳性的患者，即含菌量相对较多并且有活力的结核患者；第二部分为常规方法涂片阴性的患者，而体内存在少量有活力的结核菌，只是涂片方法无法检出，而培养仅有几个菌落，结果判定为阳性；第三部分为死菌或低活力结核杆菌，即可见而不可育菌，涂片阳性，培养阴性(其以上三种L型结核菌检查可阳可阴)；第四部分为L型结核菌，常规涂片与培养阴性，而L型结核菌检查为阳性；第五部分为死亡结核杆菌未分解的DNA，常规涂片、培养、L型结核菌检查均为阴性。以上五种分类可用传统的涂片、培养、L型结核菌检查和TBDNAPCR检查来区分，见表1。 　　　表1 五种分类的检查结果（略） 　　TBDNAPCR阳