干扰素的制备.pptxVIP

干扰素制备的工艺流程;什么是干扰素？; α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型 其区别在于个别氨基酸的差异上，早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要，现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产。 ;目的基因的分离;;一、目的基因的分离和获得;二、目的基因和克隆载体进行体外重组;三、重组体引入宿主细胞;四、从大肠杆菌k12获取目的基因;五、提取重组质粒;２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。 3、碱裂解法１）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中。溶液Ｉ:50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于４℃。;２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ:0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1％SDS盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。 ４）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml ;所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾－SDS－蛋白质－膜复合物 ５）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ和细菌裂解物混合不充分;６）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。 ７）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。 ８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用和真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。 ９）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。 10）纯化。 ;六、质粒DNA的纯化;５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。６）吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。７）将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒ＤＮＡ。８）吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。９）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释[用TE（pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD260＝50μg质粒DNA/ml）， 然后将DNA贮于－20℃。;七、对重组质粒的检测和目的基因提取;八、目的基因和表达载体的组合与导入;干扰素的发酵工艺过程;1．菌种制备 取－70℃下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30℃，pH7.0，250 r/min活化培养18±2小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 2．种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌 ;3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30℃，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温