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基于尼龙膜点杂交条件建立及优化 　【关键词】 斑点杂交 　　［关键词］斑点杂交 ；糖基转移酶；基因 　　［摘 要］ 目的：进行基于尼龙膜的点杂交条件的建立及优化。方法：采用带正电荷的尼龙膜对斑点杂交的每一步骤进行优化，包括预杂交液，杂交液，洗涤和封闭液等及各步反应时间，并采用最终确立的条件检测糖基转移酶基因多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAcT2)在K562、NB4、NIH3T3和SGC7901细胞株中的差异表达以验证膜杂交条件的可行性。结果：建立并优化了膜斑点杂交的条件，本底清晰，结果可靠。结论：建立的斑点杂交技术经济简便，切实可行。 　　Establishment and Optimization of Dot Blot Technique 　　Abstract:Objective To establish and optimize the dot blot technique.Methods We used the positively charged nylon membranes to optimize experiments for the dot blot including prehybridization solution，hybridization solution，washing buffer，blocking solutionetal，and the times of every step．In order to validate its feasibility，we analyzed the expression of ppGalNAcT2 in different tumor cell lines by dot blot assay using the established hybridizationsystem．Results we established and optimized the dot blot technique which had reliable results and low background．Conclusion The established dot blot technique is practicable and economical． 　　Key words:Dot blot;Glycosyltransferase; Gene 基因的表达分析研究是分子生物学实验中较为常用的手段，主要有Northern blot和斑点杂交(dot blot)等，因斑点杂交无需转膜，且DNA或RNA相对固定在一定的区域内，实验要求相对简单，因此斑点杂交更易为实验者所接受。目前一般均用商品化的试剂盒，但其价格昂贵，不是一般实验室所能普及，因此我们采用自配的试剂建立并优化了一套斑点杂交方法，无需特殊设备，经济简便，结果可靠。 　　1 材料和方法 　　1．1 多肽 　　N乙酰氨基半乳糖转移酶2 (UDPGalNAc：polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferases2,ppGalN AcT2 EC 2．4.1．41)基因的获得。 　　取ppGalNAcT2克隆载体转染DH5α工程菌，筛选白色阳性克隆，抽取质粒，用M13正向、反向引物进行克隆PCR，M13Forward 5GTAAAACGACGGCCAG3’，M13 Reverse 5CAGGAAACAGCTATGAC3’，电泳鉴定结果，可见约1 200 bp左右的条带。即获得相应的ppGalNAcT2cDNA片段。 　　1．2 采用T2特异的寡核苷酸探针进行斑点杂交法条件的建立及优化 　　探针序列如下5’GAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAG AAGAA，与ppGalNAcT2 cDNA序列互补，长31 bp。探针合成及探针5端生物素标记均由上海生工生物工程公司完成。 　　1．2．1 斑点杂交操作程序 　　 以上述所得pp 　　GalNAcT2的cDNA片段以1N NaOH和200 mM的EDTA对比稀释，使成0．4N NaOH和10 mM的EDTA的终浓度。 　　 把稀释的pp 　　GalNAcT2的cDNA片段在100 ℃变性5 min，迅速置冰，冰冷10 min以上。 　　 膜(购自Amersco公司，带正电荷)用灭菌双蒸水浸泡10 min，悬空晾干。 　　 每点2 μl把ppGalNAcT2的cDNA片段点在尼龙膜上，湿膜在紫外灯F照2 min，取出让膜干燥。 　　 杂交时以2×SSC浸膜5 min，装入杂交袋，根据VECTOR NIT软件计算杂交温度的方法确定杂交温度为42 ℃。以每100 cm2膜加20 ml的预杂交液(50％的去离子甲酰胺，5XSSC