碘标记直肠癌相关抗原单克隆抗体免疫显像探究.docVIP

碘标记直肠癌相关抗原单克隆抗体免疫显像探究 　　　提 要：采用非放射碘标记人直肠癌相关抗原单克隆抗体（McAb）进行肿瘤的免疫组化鉴定与免疫显像研究。应用本室制备的人直肠癌细胞相关抗原McAb，采用氯胺T法进行碘标记。经Sephadex G-10柱层析纯化，并进行免疫荧光鉴定及CT显像研究。直肠癌细胞与碘标记直肠癌单克隆抗体免疫结合后，在荧光显微镜下直肠癌细胞膜上出现鲜艳的桔黄色荧光，经CT扫描发现有阻挡X线作用，比对照管密度高出44HU，注入小鼠肝脏后，可见肝内有密度升高处，较正常肝组织高出14HU，能特异地标识出直肠癌细胞部位。结果提示：非放射碘标记人直肠癌相关抗原McAb可用于人直肠癌的免疫学诊断与生物导向CT显像研究。 　　关键词：直肠癌；单克隆抗体；免疫组织化学；碘化钠；肛肠病 　　放射免疫显像（RII）在医学研究中得到广泛应用，但RII存在同位素半衰期短、污染环境、需要专门配备ν照相机或ECT机等不足，为弥补RII的缺点，开发非放射碘的应用领域，进行了本项研究。 1　材料　人直肠癌相关抗原McAb（HM93-4McAb）和人直肠癌细胞株（HM93-4），由本实验室制备。FITC-羊抗小鼠IgG,由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。碘化钠溶液（10g/L）：碘化钠（AR）1.0g，加0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4)至100ml。偏重亚硫酸钠溶液（30g/L）：偏理业硫酸钠（AR）3.0g，加0.05mol/L磷酸盐缓冲液（7.4）至100ml。Sephadex G-10和透析袋分别由Sweden和Sigma公司提供。二氧化碳培养箱（日本三洋公司），倒置显微镜（上海光学仪器厂），洁净工作台（北京净化设备厂），低温离心机（法国乔恩公司），蛋白柱层析紫外检测仪（北京新技术开发公司），BSZ-160自动收集仪（上海沪西仪器厂），放射荧光显微镜（美国AO公司）。 1.2　方法 1.2.1　人直肠癌细胞（McAb免疫原细胞）的制备：取直肠癌标本分离细胞，在RPMI1640培养液中传代，1:1胰酶和EDTA消化，无血清1640制备细胞悬液，离心弃上清，加生理盐水，配成细胞悬液。 1.2.2　HM93-4McAb细胞株的制备［1］：取人直肠癌细胞免疫BaIb/c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经筛选鉴定获得特异性较强的能稳定分泌McAb的细胞株。 1.2.3　HM93-4McAb与直肠癌细胞间接免疫荧光试验（IFAT）［2，3］：取直肠癌细胞1×106/ml 0.5ml加入HM93-4McAb 0.1ml，37℃30min，用0.1mol/LpH7.4的PBS洗涤3次，去上清后加入PBS至0.5ml，取0.1ml滴载玻片上，用盖玻片加无荧光甘油封片在荧光显微镜下观测，结果照相。 1.2.4　碘标记HM93-4McAb（I-McAb)：采用氯胺T法标记［4，5］：取试管1支，加入直肠癌McAb（小鼠腹水，抗体效价1:200）100μl，再加入NaI溶液（10g/L）0.5ml，震荡混匀后，各加氯胺T溶液100μl(10g/L,新鲜配制)，反应1min后，加入偏重亚硫酸钠溶液10μl（30g/L）终止反应，然后加入10%KI溶液1～2滴，无黄色出现，表示反应终止完全，将此样品进行纯化。 1.2.5　I-McAb的分离与纯化：取sephadex G-10 5g,蒸馏水浸泡过夜后，洗数次后装注，观察柱内无断层、无气泡后，用0.14mol/LNaCI-0.05mol/L PBS(pH7.4)平衡，连接蛋白质紫外检测仪，波长280nm。先通过牛血清蛋白溶液（10g/L）以封闭凝胶可能与蛋白质产生吸附的活性部位，待检测仪数字下降至0时，再加入I-McAb样品液，并用缓冲液洗脱，分段收集，每管1ml；将峰1收集液装入透析袋，聚乙二醇10倍浓缩，PBS透析。为1次制备量，制备5次混合待鉴定与实验用。 1.2.6　I-McAb与直肠癌细胞间接免疫荧光试验：试验管（I-McAb与直肠癌细胞）与对照管（未经碘标记McAb与直肠癌细胞）同时进行IFAT，方法同1.2.3［6］。 1.2.7　I-McAb与直肠癌细胞结合后对X线的阻挡情况：取试管4只，管1加入未经碘标记McAb溶液0.6ml，管3加入McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液0.6ml(1×106/ml），管4（实验组）加入I-McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液0.6ml（制备方法同免疫荧光实验），将4管同置一试管架上，作CT扫描。 　 1.2.8　动物实验鉴定：取小鼠2只，在1号鼠（实验鼠）肝内注射I-McAb与直肠癌细胞结合的细胞悬液0.3ml(1×108/ml),2号鼠肝内注射直肠癌细胞悬液0.3ml(1×108/ml)。将2只小鼠背靠背排列固定，CT扫描，观