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第二代杂交捕获技术探析 　 作者：尹有群，王晓文，赵继红 【摘要】 目的：探讨如何保证第二代杂交捕获(HC2)技术的质量。方法：我院5 684例宫颈黏液脱落细胞标本进行裂解—杂交—捕获—反应—冲洗—收集信号—判读。结果：RLU/Cutoff≥1为阳性，lt;1为阴性，阳性为人乳头状(HPV)病毒感染。结论：为保证实验结果的准确性，操作时要细心严谨注意避免交叉感染，室温要恒定20 ℃～25 ℃，孵化时间要准确60 min，冲洗所用的水与冲洗的质量要保证。 【关键词】 HPVDNA；杂交捕获；探讨 　　大量资料已经证实了人乳头状瘤病毒(HPV)持续感染是子宫颈癌的主要病因，HPVDNA检测作为宫颈癌的初筛手段可更灵敏地检出宫颈癌及其癌前病变，检测的方法有很多，其中第二代杂交捕获(HC2)是唯一经美国FDA认证的可快速准确地检测出13种高危型HPV病毒的检测技术，经证实其阴性预测值高，实验的重复性好［1］，但因其方法相对繁琐，操作过程中容易交叉污染而出现假阳性，现将对我院进行的5 684例实验的一些经验介绍如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 标本来源 我院就诊的5 684例妇女的宫颈黏液脱落细胞。 　　1.2 设备 Digene公司的专用采样器、水浴箱、振荡器、加热器、Digene公司的DML 2000系统、试剂盒。 　　1.3 方法 　　1.3.1 裂解 (样品DNA双链补充释放并分解成为可以杂交的核苷酸单莲)加5滴指示剂于裂解液中混匀。加1 000 μl裂解液至阴性对照(NC)，换盖，混匀；加500 μl裂解液至阳性对照HHigh Risk Cal)，换盖，混匀；加500 μl裂解液至标本(妇科医生用专用采样器采集子宫颈脱落细胞)，换盖，混匀。放于65 ℃水浴箱裂解45 min，各管均呈紫色。换手套，配备HPV Probe B(1：25)。 　　1.3.2 杂交 (DNA单链与RNA组合探针结合为RNADNA复合体)分别吸25 μl已配好的探针B(Probe B)至96孔微孔板中各孔，再分别吸75 μl已裂解的质控(先阴性、阳性)和标本至各孔，混均，检查所有孔是否变成黄色，未变黄色的需要补加探针直至变成黄色，贴上胶纸放于加热器65 ℃孵化60 min，取出立刻撕掉胶纸，放置5 min冷却。 　　1.3.3 捕获 (第一抗体即特异性抗体与DNARNA杂交复合物固定在微孔壁上)将各孔液体(100 μl)转移至捕获孔，贴上胶纸，振荡(1 100+/100 r/min)60 min，吸出液体弃掉，将孔板用力拍打于吸水纸上至干。 　　1.3.4 反应 (偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA杂合体结合)吸75 μl DR 1(Detection Reagent 1)至各孔，盖上胶纸，在20 ℃～25 ℃放置30 min，快速翻转倒掉液体，用力拍打至干。 　　1.3.5 冲洗 用双蒸水配制冲洗液， 冲洗6次(垂直冲至底部，要有一定冲力)，于吸水纸上用力拍打，并置于纸上5 min至干，换手套。 　　1.3.6 收集信号 (碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNADNA杂合体的含量)吸75 μl DR 2(Detection Reagent 2)至各孔，置暗处20 ℃～25 ℃ 15 min。 　　1.3.7 判读 在DML 2000系统上判读，分析演绎结果，打印报告。 　　2 结果 　　RLU/Cutoff≥1为阳性，lt;1为阴性，阳性为HPV感染。 　　　3 讨论 　　HPV有100多种不同的亚型，大部分都没有致癌性，而且HPV感染后不一定会进展为高度病变，绝大部分会自然消退，而且妇女从感染HPV到发生宫颈癌一般需要5 a～10 a时间。研究表明只有高危型HPV持续感染才有患高度宫颈病变的风险，高危型HPV只有20种，最经典的只有13种，HC2是经美国FDA认证的可快速准确地检测出13种高危型HPV病毒。HPVHC2检测因其采用标准试剂盒，在DML 2000系统上判读，分析演绎结果，人为主观因素影响小，是经ALTS(多中心随机实验)的临床认证评估，证实它的确是一个可信的，实验结果在不同实验室都可重复的实验，其阴性预测值高达99%以上［1］，即如果一个妇女HPV检测结果为阴性，那么她5年内患宫颈癌的概率lt;1%。目前很多临床医生和实验室工作人员对LSIL和ASCUS都感到束手无策，所以有很高阴性预测值的HPV检测正好给临床医生提供了一个更好的解决方案，从而预测出宫颈癌的患病风险。HC2试验的基本原理是在分子水平采用基因杂交—化学发光—信号放大的检测技术对HPVDNA进行定量检测。检测结果的判断标准是RLU(相对光单位，光信号)/Cutoff(域值=三个阳性质控指标的平均值)≥1为阳性，