PI3K抑制剂体外对弱精子症患者精子运动参数的影响.pdfVIP

材料和方法 一、主要试剂 1、LY294002inSolution 美国Calbioehern公司 2、Earle平衡盐溶液(EBSS)美国GIBCO公司 3、牛血清白蛋白(BSA) 美国GmCO公司 二、主要仪器 l、CASA系统 杭州麦迪公司 2、DT5．3低速自动平衡离心机 北京时代北利有限公司 3、光学显微镜 日本OLYMPUS公司 11 4、微量移液器(10、200、10001) 德国EPPENDORF公司 5、恒温水浴箱 新康医疗器械有限公司 三、实验对象分组 精液标本均来自我院男科治疗中心。按照WHO推荐标准【11分为弱精子症组(a 子≥50％)。弱精子症组的纳入标准是特发性弱精子症，剔除少精子症、畸形精 予症及有明确病因的精子活力低下，如生殖道感染、激素水平异常、精索静脉曲 张、全身性疾病或环境因素等；正常组选取有生育史的男性，并且剔除生殖道感 染、激素水平异常、精索静脉曲张、伴发全身性疾病者。弱精子症组与正常组各 lO例，年龄为22～38岁。 6 垒士墨挂占至日叠匡至醢 ：至蝤盔蔓±至焦叠主 四、精子培养液配制 精子培养液成分如下。配好后常温下储存备用。 l、50ml Earle平衡盐溶液(EBSS) 2、300mg牛血清白蛋白(BSA) 3、1．5mg焦丙酮酸钠 4、O．18ml乳酸钠(60％糖浆) 5、lOOmg碳酸氢钠． 五、LY294002溶液的配制 二甲基亚砜(DMSO)]，分别用EBSS溶液稀释成0．2、2，20tl mol／L应用液，棕 色瓶分装冷藏备用。所有溶液使用时均预热至37℃． 六、精子悬液制备 患者禁欲4～7d后手淫法留取精液，标本立即放入37℃密闭恒温箱中，待精液 标本液化后按wHO推荐方法[”经上游优化处理，再用Earle平衡盐溶液(EBSS， 美国GIBco公司1调节精子密度至约80×106／m1． 上游优化处理步骤： l、微量移液器吸取lml液化精液加入已消毒的lOml玻璃试管中； 2、在精液上方轻轻加入精子培养液1．2ml，注意应沿管壁轻轻加入，使精液 与精予培养液分界清晰； 3、将试管置于37(2密闭恒温箱中孵育1小时，注意将试管倾斜45度以增加两 层液面接触面积； 4、轻轻将试管竖直，静置2分钟后微量移液器移取最上层的lml培养液(Or 7 生士璺越太至曼洼垂生醢 趔盘曼±至焦盘主 优化后的精子)； 5、将此lml培养液稀释至8ml，500×g离心5分钟； 6、将沉淀物重悬于0．5ml精子培养液中，即得优化后的精子悬液。 七、实验步骤及分组 l、 弱精子症患者和精液参数正常男性各lO例手淫法留取精液； 2、 精液经上游优化处理； 3、 调节精子密度至约80X106／ml； 4、 精子悬液(密度约40X106／m1)与不同浓度的n陀94002孵育； lI p1 A组：1001精子悬液+100 E