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牛血凝血酶的分离 学院：环境与化学工程学院 专业：09级生物化工 姓名：史翠格 学号：090110050009 牛血凝血酶的分离 凝血酶原是糖蛋白，糖含量约占11％，电泳时分布在α2-球蛋白部分。凝血酶原经激活剂激活而转变成凝血酶，是一种蛋白水解酶。在血液凝固过程中，一种被称为“凝血酶原激活物”的复合物能有效地催化凝血酶原，把分子量72000[1]的凝血酶原水解成分子量38000的凝血酶和多肽，从而达到止血的目的。 20世纪六、七十年代，主要应用等电点沉淀、有机溶剂沉淀及溶解、CaC12，激活凝血酶原和高速离心技术从血浆中提取纯化得到凝血酶，方法虽然简单、容易操作，但产量和效价较低。进入20世纪九十年代，出现了一些提取和纯化凝血酶的新方法，虽然能得到较高纯度和活力的凝血酶，但工艺复杂、用时长、造价高。本研究综合上述方法，探讨从牛血中提取纯化凝血酶的方法，以期探索一种既能提高产率和比活，义操作简单、价格低廉的生产方案，在工艺和产量上达到突破。 方法一 采用DEAE离子交换纤维素柱层析和SephadexG—200分子筛层析从牛血浆中纯化得到牛凝血酶。 这种方法得到的凝血酶保持了较高的活力和回收率，具有方法简便、效果较好的特点。 1 材料与方法 1．1 材料 采集屠宰时流出的新鲜牛血，桶中预先加入柠檬酸钠溶液(3．8％柠檬酸钠：牛薛(v／v)=l：10)做抗凝剂。 1．2 牛凝血酶的分离纯化 全部操作除特别说明外均在0-4℃下进行。 1．2．1 等电点沉淀法粗分离凝血酶原 将加入抗凝剂的牛血4000r／min离心20min，蒸馏水稀释8倍后，1％醋酸调pH至5．5，4℃静置过夜。弃上清，4000r／min离心15min，收集沉淀。将沉淀悬于1／3原血浆体积的0．075％草酸钾一0．9％NaCl溶液中，搅拌10min，用0．1％ Na0H调pH值至6．5，搅拌50min，4000r／min离心20min，收集上清，即为凝血酶原。 CaCl2激活凝血酶原：向酶原液中加入CaC12溶液，使终浓度为0．1mol／L，室温静置2h激活后，4000r／min离心25min，收集上清液，在沉淀中加入70ml 0．075％草酸钾 0．9％NaCl溶液搅拌20min，再次离心取上清. 两次上清液合并即为凝血酶粗品。 1．2．2 凝血酶的纯化： (1)离子交换层析：将上述凝血酶粗品上样于0．05mol／L pH7．0 Tris—HCl缓冲液平衡好的DEAE一纤维素柱(3cm×20cm)，相同缓冲液充分淋洗后，改用含有0．15mol／L和0．3mol／L NaCl的缓冲 液分别洗脱，流速为45ml／h，分部收集洒性部分，并测酶活。 (2)凝胶过滤层析：取40ml有活性的离子交换层析洗脱液装入透析袋，蔗糖包埋浓缩，上样到事先用pH=7.0 Tris-HC1缓冲液平衡好的Sephadex G-200柱(lcmx60cm)，并用相同缓冲液洗脱，流速为30ml／h，分部收集活性部分，即为凝血酶制品，并测酶活。 1．3 凝血酶活力的测定 用0．9％NaCl溶液溶解纤维蛋白原，调pH值至7．0-7．4，浓度为0．125％(W／ V)。取一排小试管，每管加入0．4ml纤维蛋白原溶液，37℃水浴中保温l min以上，以喷射式加入0．1ml不同稀释倍数的凝血酶样品溶液，迅速摇匀，同时按下秒表开始计时。继续在水浴中保温一段时间(少于预期的凝集时间)。取出试管，轻轻倾斜，观察其中溶液流动情况，记录凝固时间。若为l5s，则所加凝血酶液活力为5U／m1。 2 结果 2．1 凝血酶粗酶 26L新鲜牛血加入2．6L柠檬酸钠后，离心得l5L血浆，经稀释后，进行等电沉淀得到505.5g的凝血酶原，即牛凝血酶原含量为505．5g／26L=19．44g／L。每次取2 凝血酶原经酶原活化，将所得粗酶稀释后测酶活，数据：所得凝血酶粗酶的比活为5．205U／mg，可见其比活较低，原因是粗酶中含有变性的蛋白和杂蛋白。 2．2 离子交换层析结果 具有活性的洗脱液数据由实验可以得出。 与凝血酶粗酶相比，离子交换层析得到的凝血酶比活从5．205U／mg提高到了8．664U／mg，纯化倍数提高到1．7。 2．3 凝胶过滤层析结果 收集Sephadex G-200凝胶过滤的活性部分，即为凝血酶制品，可以测数据。与离子交换层析洗脱液相比，凝血酶制品的比活从8．664U／rag提高到了39．804U／rag，纯度也从1．7提高到了7．6。 通过以上纯化步骤，得到了比活为39．804 U／mg的牛凝血酶制品，回收率为34．3％，纯化7．6倍。 3 讨论 本实验以牛血为原料对凝血酶进行了分离纯化，所得凝血酶制品比活为39．8U／rag蛋白，活性回收率为34．3％，纯化倍数为7．6。与同类实验相