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生物化学大实验报告 ——谌星 生物学（基地） 【摘要】碱性磷酸酶是适于在pH约910的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称它的作用是催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5-Pi末端转换成5-OH末端这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E. coli 中表达。先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代β-D—半乳糖），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。联机上样标准曲线的通过亲和柱纯化后的样品再通过离子交换层析进行纯化 （1）. 过夜BL菌以150扩培比进行扩培，至OD600＝0.5190 r/min约1 h20 min，然后加入IPTG至终浓度为1 mM于28 °C，160 r/min190 r/min条件下诱导5 h。 诱导表达后的菌体5000 r/min离心15 min，弃去LB培养基。按101体积比重悬于破碎缓冲液中starting buffer），5000 r/min离心10 min，弃上清，加入破碎缓冲液以及终浓度为1 mg/mL的溶菌酶，30温浴15 min。 冰浴条件下60％功率5 min，超声4 sec间隔12 sec再用40％功率5 min，超声4 sec间隔12 sec。（超声要求：a.将菌清亮；b.始终保持低温环境；c.黑色沉淀）将超声后的样品于42000 r /min离心10 min沉淀为细胞碎片，弃去。再于412000 r/min离心10 min，沉淀即为包涵体可用破碎缓冲液冲洗两次，将1mL裂解液对应的包涵体溶于00 (L 8 M/L尿素中将上清再次于412000 r/min离心10 min，杂质。°C保存至少1mL可溶性蛋白粗提液用于碱性磷酸酶活力和比活力。 （5）. 镍柱亲和层析纯化可溶性蛋白： ①将亲和层析介质用柱体积灭菌超纯水冲洗②用5柱体积starting buffer进行平衡③将可溶性蛋白样品反复过柱次④用含30mM 咪唑的wash 冲洗12柱体积⑤用3 mL含有300 Mm 咪唑的elution buffer洗脱目的蛋白，500 (L收集每收集500 (Lelution buffer孵育柱子5min）； ⑥SDS－PAGE检测蛋白纯化效果蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，且具有相似的形状，在电场下，按相对分子质量大小在凝胶胶上排列。蛋白条带经考马斯亮蓝R250染色后形成肉眼可见的蓝色条带，并可用凝胶成像系统分析条带蛋白含量和相对分子质量。印迹法一般由凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。 ①取出凝胶，切去浓缩胶，分离胶也可以做适当裁减（电泳时最好使用预染Marker这样在以后可以检查转移效率）。用灭菌去离子水冲洗，然后放入转移缓冲液中浸泡平衡。 ②戴乳胶手套将PVDF膜裁成和需印迹凝胶相似而略大的小块，用100％甲醇处理15S（不可超过），然后放入转移缓冲液中平衡15min。 ③海绵垫2块放入转移缓冲液中浸泡到没有气泡；将滤纸裁成比凝胶和硝酸纤维素纸略大的片，共4片，转移缓冲液中浸湿，然后按以下顺序组装转移装置：阴极黑板－海绵垫－2层滤纸－凝胶－PVDF膜－2层滤纸－海绵垫－阳极红板。 ④恒流80mA转移2.5-3h，可于冰水浴中操作。 ⑤ 卸去装置，取出PVDF膜置于干燥滤纸上片刻，但勿使膜变干，然后转移到灭菌去离子水中。 ⑥将膜转移至杂交袋中，加入5mL封闭液（5mL BST+0.25g脱脂奶粉），排出气泡，封口，摇床上室温封闭2h，可以过夜。 ⑦将杂交袋剪一小口，弃去封闭液，加入含有uL一抗的封闭液mL，排出气泡，摇床上室温摇动10min，4℃过夜做一抗孵育（或23h过中午）。 ⑧将杂交袋剪一小口，回收一抗溶液并放于4℃（若使用已经超过1次则可以弃去）。用BS漂洗膜洗3次，每次10min（摇床上）。 ⑨加入含有uL二抗的封闭液5mL，排出气泡，摇床上室温摇动1.5-2h做二抗孵育。 ⑩回收二抗溶液并放于4℃（若使用已经超过1次则可以弃去）。用BS漂洗膜洗3次，每次10min（摇床上）。 取1片DAB片溶于37℃预热的灭菌去离子水中，用前加入30％的H2O2 33uL，即终浓度为0.1％。将膜置于平皿中，倒入上述显色液，暗处色min，条带清晰后用灭菌去离子水终止反应，漂洗一遍，凝胶影像系统中迅速记录结果。 酶活力的测定①将在37 ℃温浴5 min。 ②测组样品的酶活力a.纯化前的可溶性蛋白；.纯化后的可溶性蛋白；. BAP标准品；d.空白对照只加入相应量的超纯水。