饲料中三聚氰胺的检测方法.docVIP

饲料中三聚氰胺的检测方法 ? l三聚氰胺的性质 1．1物理性质 分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3，分子量126．12,为纯白色单斜棱晶体，无味，低毒，密度1．573 g／cm3（16℃）。常压熔点354℃(分解)；快速加热升华，升华温度300℃。溶于热水，微溶于冷水，极易溶于热乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。在一般情况下较稳定，但在高温下可能会分解放出氰化物。 1．2化学性质 ??? 三聚氰胺的水溶液呈弱碱性(pKb=8)，与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性环境中(pH值5．5-6．5)与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸。三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物，其中三聚氰胺与甲醛水溶液的反应是最重要的反应。 2饲料中三聚氰胺的检测方法 2．1试剂盒检测法fELISAl 利用萃取液通过均质及震荡的方式提取样品中的三聚氰胺进行免疫测定。 2．1．1样品处理 称取1．0 g均质过的饲料样品于离心管中，加入10 ml甲醇充分混合,15 000 r／min离心10 min,取上清液1 ml于小试管中用氮气吹干，加入2．5 ml 10％甲醇和20 mmol／l PBS溶液充分溶解，移取100ul进行分析。 2．1．2 ELISA检测步骤 将所有试剂及样品提取液回升温度至室温(20～28℃)，用前按试剂盒的要求稀释所用试剂．取相应数量的微孔条，插入框架，吸取100ul标样或样品提取液到相应的微孔，每孔加入50ul三聚氰胺HRP酶标记物，轻轻混合60 s，孵育30 minf20-28℃）。然后，将微孔中的溶液倒入水槽中，用250ul洗液洗板5次；在吸水纸上拍打，尽可能将水拍干；每孔加入100ul底物溶液，孵育30 min(20-28℃)，每孑L加入100ul终止液，用酶标仪读取在450 nm下的吸光值。 2．1．3作图??? 以所获得的标准和样品吸光值的平均值除以0标准的吸光值再乘以100为纵坐标，以三聚氰胺浓度半对数为横坐标作标准曲线，确定被测样品的浓度。 2．2液相检测法和气相色谱一质谱检测法 ①试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，将提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定；②净化后的洗脱液用氮气吹干，用N，0一双三甲基硅基三氟乙酰胺fBSTFA)衍生化，以气相色谱一质谱联用仪进行定性和定量测定。 2．2．1样品处理 称取5．00 g试样，准确加入50 ml三氯乙酸溶液(10g/l)，加入2 m1乙酸铅溶液(22g/l)，摇匀，超声提取20 min，静置2 min，取上层提取液约30 ml转入离心管，在12 000 r／min离心5 min。分别用3 ml甲醇、3 ml水活化混合型阳离子交换固相萃取柱。准确移取10 ml离心液分次上柱，控制过柱速度在1 ml／min以内．再用3 ml水和3 ml甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，抽干后用5％氨化甲醇3 ml洗脱，洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入2 ml甲醇溶液，涡漩振荡1 rain，过0．45 I．zm膜，用高效液相色谱仪测定三聚氰胺含量。 2．2．2衍生 根据液相的定量结果将洗脱液稀释成浓度约为0．5 Ixg／ml。分别吸取稀释液0．5 ml用氮气吹干，加入250ul吡啶和250ul衍生试剂，加盖，混匀，70 cc反应30 min，同时吸取0．5ug／ml的标准溶液0．5 ml做同步衍生，用气相色谱一质谱联用仪确证。 2．2．3仪器条件 ? ①液相色谱条件 ? 紫外检测器，波长240 nm；色谱柱ZORBAX E— clipse XDB-C8,柱长150 mm，内径4．6 mm，粒度5 Ixm；流动相A：B=93：7(A：称取庚烷磺酸钠2．02 g和柠檬酸2．10 g溶解，定容至1 L；B：乙腈)，流动相流速1．0 ml／min，进样量10ul。 ??? ②气相色谱一质谱联用仪条件 色谱柱VF-5ms 30 m 0．25 mm 0．25um capillaiy column；进样口温度：250℃；进样量：1ul；柱温：起始温度75℃，保持1 min，以30~／min升温至300℃，保持2 min；载气、氦气流速：1-3 ml／min；传输线温度：280℃；溶剂延迟5．5 min；EM电压：高于调谐电压200 V，离子阱温度：220℃；选择离子监测：fM／Z)99、171、327、342。 2．2．4标准溶液的制备 精密称取三聚氰胺标准品0．100 0 g，置于100 ml容量瓶中