猪瘟病毒中国标准强毒株--F114株全长cDNA的构建.pdfVIP

41卷 4期 微 生 物 学 报 Vol 4l 0．4 2001年 8月 ActaMicroblologica Sinica August 2001 猪瘟病毒中国标准强毒株——F114株全长cDNA的构建 聂玉春 柯叶艳 阵建国 丁明孝 (北京大学生命科学学院 北京 IOO871) 摘 要：应用 RT-PCR技术，分段克隆了猪瘟病毒中国标准强毒株 FII4株的全基因组，经测序 验证，用 DNAman软件比较分析与其它几个代表毒株的同源性，发现与 Brescia、Alfort及 C株 桩苷酸序列同源性分别为 96 80％．86 03％和 95 70％，氨基酸序列同源性分别为 98．54％， 93 33％和 97 41％ 将各段 eDNA连接到 口cEM-T和 pBluesefiptII sk‘质粒，得到两个亚克隆 sk．ol64(即 sk 质粒中插^片断为 1—0441a~，依次类推)和 sk一64122,，再将两个亚克隆连接成 sk一12297，即CSFV全长 eDNA克隆。 美键词：猪瘟病毒．全长eDNA，序列同源性 中固分类号：$852．65 文献标识码：A 文章编号：OO01—6209(2001】04．0452—05 猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)是引起猪高度传染性疾病——猪瘟的致 病原，与羊边界病病毒(Border Disease Virus，BDV)、牛病毒性腹泻病病毒(Bovine Viral Diar- rhea Virus，BVDV)一起构成黄病毒科的瘟病毒属。猪瘟病毒是基因组长约 12．3kb的正链 RNA病毒，一个大ORF编码约3900个氨基酸多肽，在翻译过程中或翻译后被加工成结构 和非结构蛋白 。 。尽管猪瘟病毒仅编码 1l～l2个蛋白，但它与宿主细胞的相互关系比 较复杂，其致病相关蛋白方面的研究缺乏有力证据，研究猪瘟病毒的致病机理进展缓慢。 从全长eDNA恢复有活性的病毒粒子这一手段的成熟及应用，是研究病毒的致病因子、 RNA复制、病毒基因产物的功能、阐明病毒的致病机理等极具价值的工具。目前已在多 种正链RNA病毒中成功应用。国外文献已报道了构建 CSFV的 C株和 Alford／187株、 BVDV的NALD株等的垒长cDNA，并用于研究病毒单个蛋白的功能，取得了一些可喜进 展 。。。本实验用我国标准强毒株(石门株)为材料，构建了，CSFV垒长cDNA，为研究猪瘟 病毒增殖、致病机理及中国强弱毒株之间的关系提供了理想的材料。 1 材料和方 法 1．1 病毒与细胞 石门株Fll4脾淋毒(购自中国兽药监察所)，在PK-15细胞上复壮至第五代，差速离 心法纯化病毒，用盐酸胍裂解法提取RNA，用于RT—PCR。 I_2 载体与引物 所用载体有pBluescripl 11 sk‘、pGEM—T和 pET-28a等。Taq酶 Elongase sv~em、反转录 国家攀登计划资助项目( 0 85—44-02~35)和国家重点基础研究发展规划项目(G199~3119~4)资助 “通讯作者 作者筒舟：最 春(1973一)．男，安徽和县^．北京太学博士研究生．从事病毒分子生物学和细胞生物学研究 收稿 日期：2000417．24．俸回日期：2001—01 12 4期 聂玉春等：猪瘟病毒中国标准强毒株——Fl14株全长 eDNA的构建 453 酶 Superscript II和 T4 DNA连接酶均购自Life Technology，lne．，限制性内切酶购自NEB和 Promega公司 根据已发表的猪瘟病毒C株及Breseia序列设计引物，由塞百盛生物公司合成。引物 名称为“P”表示上游引物，…N’表示下游引物，数字表示引物5’端对应的病毒基因组中碱 基位置。 P1：AGATIG从 TTCG TCG ACT从 T ACG ACT CAC TAT AGT ATA CcAGGT TAG rI℃ A_几 CTC N1298：(X；A CTC CTr TGC ATA TrT TrT CCG GC P11