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细胞学研究方法 第一章 植物染色体制片技术 染色体是细胞核中由DNA、蛋白质和少量RNA组成的易被碱性染料着色的一种丝状或杆状物。也是遗传物质的载体。它可被苏木精、蕃红、结晶紫、吉姆萨、醋酸洋红、地衣红和孚尔根染液等染色。染色体为细胞中最重要的遗传结构。 一、染色体研究技术的发展历史 1888年瓦尔德第一次提出了染色体这一名词。 1910年摩尔根研究果蝇的染色体以来，染色体研究进入了鼎盛时期。 染色体的制作方法和技术始终是一大难关。在E．B．Wilson的巨著((The Cell)的1947年版本中，H．de Winiwarter于1912和1921两次定的人的二倍体染色体数是47和48，T．S．PainLer于1921和1922定的数目，单倍体是24，二倍体是48。 1956年J．H．与A．1evan在瑞典的Hereditas 上发表‘人的染色体数’时，确切是46。 而技术上加以突破性改进的两人竟都是搞植物细胞遗传的，而且第一作者， Tjio是一位中国人，名字叫蒋有兴。其发表的照片质量高，它可以使任何未经专门训练的人，不但能数清染色体数目，而且还能给每个染色体找到它的同源伙伴。 Belling（1921）创用的乙酸洋红染色压片法，带动了以研究染色体数目、结构和行为变异与遗传的细胞遗传学和细胞分类学的建立和发展； Caspersson（1969）首创的染色体分带技术，揭示了染色体的内部结构分化，使对染色体的鉴别和分析更为准确； 同年，Gall等创建的DNA分子原位杂交技术及其以后的不断改进，现已发展可以对单拷贝基因、重复序列以及整个基因组DNA进行准确定性、定位和相对定量的研究。 二、染色体制片技术 2.1制片方法的选择 国内外通用的制备植物染色体标本的基本方法是压片法和去壁低渗——火焰干燥法。前者为传统技术，后者为70年代末由陈瑞阳创用的新方法。 国外，仍以压片为主；在国内，两种方法都普遍应用，只是个人有偏爱而已。 其具体的染色体制片方法如下图： 2.2制片程序 2.2.1取材（基础） 原则：进行细胞分裂的分生器官、组织或单个细胞均可。 根尖：取材方便，分生区集中易判断。 禾本科，单子叶0.5-2cm； 双子叶，2-4cm（大），0.5-1.5cm（小） 裸子植物，2-4cm。 提高分裂指数：同步化处理、变温处理（4-10℃） 茎尖 效果比根尖差，受季节限制，分裂指数低，不适宜用压片法。芽长0.5cm内。 幼小花蕾 比茎尖有价值，因处于花粉母细胞减数分裂之前，有用的部分是花药和子房。纵切为二或四进行处理。 愈伤组织 因为老化和分裂的细胞混杂，所以较困难，应以转至新的培养基，愈伤组织大量增殖时取为适宜。 2.2.2预处理（关键） 预处理作用 抑制微管蛋白组装成纺锤丝，但并不抑制前期的细胞分裂，因此，凡进入中期的均被阻而不能进入后期，积累大量中期分裂相。 可诱导染色体进一步缩短变直，便于染色体分散和使染色体形态更清晰。 2、预处理药物的种类、特点及选择 秋水仙素（colchicine），常用浓度0.05-0.2%水溶液，易溶于冷水，有剧毒；高温与照光易失效，现配现用。适用于大、中、小染色体。 对二氯苯（p-Dichlorobenzene pDB），常用饱和液，溶于乙醇等有机溶剂，难溶于水。适用于大、中、小染色体，尤其适合染色体计数；使染色体易于分散较好，但显示缢痕较差。 8-羟基喹啉（8-hydroxyquinoline），多用0.002mol/L水溶液。适宜中、小染色体，离体处理好。优点在于显示缢痕清晰，缺点在于中期分裂相不如其他的多，但总体优于其他药物。 α-溴萘（α-Bromonaphthalene ）,饱和液现配最好，适于禾本科及水生植物，活体处理。100ml加2滴即可。 放线菌酮（cycloheximide）,适宜早中期染色体供核型分析和G-带研究。20-50ppm，小染色体用低浓度，大染色体用高浓度 混合处理液 对二氯苯+α-溴萘，100ml对二氯苯饱和液加1-2滴α-溴萘，对大、中染色体作用迅速。可在短时间内明显缩短。 秋水仙+8-羟基喹啉，等量混合。适做核型。 8-羟基喹啉+放线菌酮 3、预处理方法 A、离体处理 即将器官、组织从母体上切割下来处理。 注意事项： 1、材料要少，大≤10，小≤15 2、材料要小，切口邻近分生区，2-3mm 3、经常振摇 4、处理期间，更换预处理液 5、尽量避光处理 6、温度在20℃左右为佳，最忌高温。 B、非离体处理 主要指根尖材料。 许多蔬菜和花卉的种子小、根也小。 染色体较大的植物。 C、其他方法（低温处理） 适当低温，也可抑制微管蛋白的合成与组装成纺锤体，与药物有相同功效。但适用的作物类别少