双向疑难解答.doc

1、IEF问题 等点聚焦之后在酸端有3-4厘米呈乳白色，其他地方是透明的。有没有人遇到这种现象啊，是什么原因啊？最后是如何解决的？ 求高手解答啊 等点聚焦之后胶条的厚度不是很均一，有一块比其他地方厚，不知道是什么原因。泡胶没出问题，泡完之后厚度均一，就是等点聚焦之后有的地方厚，不知道什么原因，求高手解答，谢谢回复 你的问题和我的一样，我也出现过，只要出现这样的情况，一般第2向出来结果在酸性端有横向脱尾。用硫脲的时候会发白，但是平衡后基本消失，在我的实验中对后期结果没有影响。胶条等电聚焦后，整根胶条是不平整的，可以看到许多隆起，在电极附近的胶条部分很厚是聚焦时离子在电极附近聚集然后胶条膨胀造成的，影响不大，注意平衡时不要弄掉用硫脲的时候会发白，但是平衡后基本消失，在我的实验中对后期结果没有影响。胶条等电聚焦后，整根胶条是不平整的，可以看到许多隆起，在电极附近的胶条部分很厚是聚焦时离子在电极附近聚集然后胶条膨胀造成的，影响不大，注意平衡时不要弄掉2D谱疑难解析这是网上列举的部分实例，有些是很有参考价值的，有些值得商榷，欢迎讨论[很想知道都那些专家得出的建议，以便特邀讨论。这个是标准2D谱 以下是参考谱和参考分析— 氨基甲酰化（Carbamylation trains）导致太多蛋白斑点串，不属于常规的磷酸化等修饰可能原因：尿素（urea）不纯建议：用更纯的尿素，避免样品加热，或者用Amberlite IRN-150L去异氰酸盐（isocyanate） 蛋白样品制备步骤错误导致蛋白丢失可能原因：样品制备TCA/丙酮沉淀后用预冷的丙酮洗涤沉淀，导致TCA残留建议：用90%丙酮/10%H2O洗涤,可以彻底洗去TCA不同的样品制备步骤导致完全不同的蛋白斑点图谱 右边的垂直条带包含了所有pIs值pH7的蛋白。可能原因：？？建议：？？？？ 样品含高丰度蛋白导致出现水平条带可能原因：高丰度蛋白聚集后，若采用胶面朝下的胶条槽，易造成水平条带。建议：采用杯上样胶条槽或manifold等胶面朝上的胶条槽。 出现水平条带（窄pH范围胶条）可能原因：聚焦不够，或者盐离子过多造成水平条带的其它原因：Detergent去污剂浓度过低尿素浓度过低DTT浓度过低，或者用量过少上样位置不合适（比如cup loading）蛋白酶活性胶条溶胀时间过短样品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr / 40,000 g) 空气中的CO2 试剂不新鲜可能原因：TEMED不新鲜。建议：尽管TEMED用量很少，还是建议每年更换一瓶TEMED。 试剂质量影响蛋白斑点成像可能原因：Tris质量不好 步骤错误导致蛋白丢失可能原因：蛋白转移电压过高（400V，18cm胶）——在开始的45分钟内不要超过2W/gel（Ettan size） 植物样品可能原因：多糖未去除干净，被考马氏亮蓝染色建议：样品用clean-up处理 蛋白斑点出现垂直条带可能原因：平衡过程中DTT不足，导致一些蛋白出现垂直条带。 样品中含盐等离子过高可能原因：样品中含盐等离子杂质过高，导致等电聚焦失败。建议：避免过多盐，需除盐，如在洗细胞时要把PBS在离心后彻底移除，或在最后一步清洗时采用250mM蔗糖/10mM Tris 洗细胞。 pH6－11的胶条Rehydration Loading Cup loading 建议：对于碱性pH范围胶条，用杯上样效果更好 保存第二向凝胶时温度太低可能原因：保存第二向凝胶时温度太低， SDS有沉淀建议：长时间保存（2days - 2weeks）在4－8， 在二向进行前应提前把凝胶取出，室温放置。求助！！！关于IEF 好奇怪 一样的样品和一样的试剂 上周IEF电流正常电压能上去我重新配了一个1MDTT重新跑就电压死也上不去了到了8000就不行了（胶条是18cm的）一直掉到3000 DTT确实没配错求各位赐教！ 回复 1M 的DTT，太大了吧，一般是20－100 mM DTT.不是啊 是配成这个母液 然后加在水化液里面 蛋白提取时，TCA和丙酮的作用是什么？ 用三氯乙酸和丙酮提取蛋白时，TCA和丙酮的作用分别是什么？ TCA： 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐；? ??? 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀；? ??? 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大。丙酮：抽提TCA老生谈电泳-等电聚焦 介绍：蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带不同的电荷或者不带电荷，对于每一个蛋白质而言都有一个特定的pH，此时蛋白质的净电荷为零，其在电场中不发生移动，此时环境中的PH即为该蛋白的等电点（pI）,等电点通常在pH3-12之间（大多数在4-7之间），所以目前常用的两个pH胶条范围是3-10（IPG胶条的材料一般只能达到