农杆菌介导甘蔗愈伤组织遗传转化体系的优化.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（９）：６６７２ 农杆菌介导甘蔗愈伤组织遗传转化体系的优化 １，２ １，２ １，２ １，２ ２，３ 秦翠鲜 　陈忠良 　桂意云 　汪　淼 　周建辉 　 ２，３ １，２ １，２ 廖　青 　李杨瑞 　黄东亮 （１广西农业科学院甘蔗研究所 广西甘蔗遗传改良重点实验室农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室　南宁　５３０００７） （２中国农业科学院甘蔗研究中心　南宁　５３０００７　３广西农业科学院　南宁　５３０００７） 摘要　以甘蔗胚性愈伤组织为材料，对愈伤组织增殖、分化、幼苗生根的最适抗生素（Ｋｍ）浓度进 行筛选，并对影响农杆菌介导的甘蔗遗传转化因素：预培养时间、侵染时间和共培养时间等进行 了研究。最后确立了甘蔗愈伤组织增殖、分化及幼苗生根三个阶段的最适抗生素（Ｋｍ）浓度分别 为３００ｍｇ／Ｌ，４０ｍｇ／Ｌ，２０ｍｇ／Ｌ。确定了农杆菌浸染的预培养时间、侵染时间和共培养时间分别 为４ｄ，３０ｍｉｎ，４ｄ。ＰＣＲ检测表明，６１．６％的抗性植株可扩增出预期的片段，表明外源基因已经整 合到甘蔗基因组中。为进一步的甘蔗基因功能验证及转基因研究提供良好的技术支撑。 关键词　甘蔗　农杆菌　遗传转化 中图分类号　Ｑ９４３ 　　甘蔗（ＳａｃｃｈａｒｕｍｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍＬ．）是重要的糖料作 难以应用农杆菌介导转化的物种［６］。但是，在水稻等 ［１］ 禾本科植物农杆菌浸染转化方法取得进展的基础上， 物和能源作物，对我国经济发展具有重要的意义 。 甘蔗育种是蔗糖生产的核心技术，改良和更新品种是 农杆菌介导的甘蔗遗传转化也取得了重要进展。 ［７］ 发展蔗糖生产最经济有效的措施。目前甘蔗育种以杂 Ａｒｅｎｃｉｂｉａ等 于１９９８年初步建立起了农杆菌介导甘 ［８］ 交育种为主，由于甘蔗是高度杂合的非整倍性异源多 蔗遗传转化体系。Ｅｎｒｉｑｕｅｚｏｂｒｅｇｏ等 采用农杆菌介 ［１］ 导甘蔗愈伤组织法，获得了抗除草剂的转基因甘蔗植 倍体植物，遗传背景相当复杂 ，利用传统育种方法从 ［９］ 有性杂交到良种育成的周期长、成效低，一般育成一个 株。Ｅｌｌｉｏｔｔ等 将带有荧光蛋白（ＧＦＰ）基因的ＡＧＬＯ ［２３］ 菌株转化甘蔗胚性愈伤组织，获得了转 ＧＦＰ基因的甘 品种需要１０～１２年时间 。利用转基因辅助育种，可 以大大提高甘蔗育种的效率。常用的外源基因导入技 蔗植株。但农杆菌侵染甘蔗的效率不高仍是该转化方 ［１０］ 术主要有农杆菌介导法、基因枪轰击法和花粉管通道 法的主要障碍 。所以优化农杆菌介导的甘蔗愈伤组 ［４］ 织遗传转化体系，提高甘蔗遗传转化效率，对甘蔗转基 法等 。其中，农杆菌转化法具有转化效率较高、操作 简易、快捷等优点，是 目前植物遗传转化的主要手 因育种具有重要意义。 ［５］ 　　研究对甘蔗愈伤组织增殖、分化、幼苗生根三个阶 段 。８０％以上的转基因植物是通过农杆菌介导法获 得的。