Western Blotting(半干转) 超级详细步骤.pdfVIP

Western Blotting Analysis Guide （半干转） Western blotting (半干转)可分为以下9 个步骤： 一、蛋白的提取 A 总蛋白提取 1. 将收集的细胞或组织(约0.1 g)从-80 C 冰箱取出，按1:10 (w:v)加入冰浴的蛋白裂解液 (RIPA) ；并加入1/ 10 体积的蛋白酶抑制剂 PMSF） 2. 用 Dounce 手动匀浆器或电动匀浆器，匀浆细胞或组织（注意：全程冰上操作，每个 样品用 Dounce 上下抽动相同的次数，电动匀浆器匀浆相同的转速及时间） 3. 冰上静置 20 min 后，12000 rpm 离心，4 C，15 min ，取上清。 B 核蛋白提取 1. 称取 100 mg 肝脏冰冻组织置于 Dounce 手动匀浆器，加入1 mL 冰浴的核蛋白裂解 液A，上下抽动 5 下 （注意：全程冰上操作，不同组织上下抽动需摸条件，匀浆后能看到些 许小组织块） 2. 将匀浆液倒入 1.5 mL 离心管，瞬时离心 30 s 3. 上清倒入另一 1.5 mL 离心管，冰浴 5 min 4. 3000 rpm 离心，4 C，10 min ，上清倒入另一 1.5 mL 离心管收集 （此为胞浆蛋白） 5. 沉淀加入 50 μL 核蛋白裂解液 B 吹打，冰浴 20 min 6. 12000 rpm 离心，4 C，20 min ，将上清吸入 0.5 mL 离心管收集 （此为核蛋白）。 二、蛋白浓度的测定 2+ + + 在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu 还原为 Cu ，一个 Cu 螯合二个 BCA 分子，工作试剂 原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。 1 BCA 标准品和样品的准备： BCA 标准品为5mg/mL） 配制1mg/mL 的标准品：取10 μL 原标准品+ 40 μL PBS 缓冲液混匀，浓度为1mg/mL 配制0.25 mg/mL 的标准品：取5 μL 上述1mg/mL 的标准品+ 15 μL PBS 缓冲液混匀，浓 度为0.25 mg/mL 样品用水以1– 5 倍稀释，并且将蛋白裂解液用PBS 缓冲液按相同的比例稀释作为样品的 空白对照 （建议样品稀释2 倍，不同组织使用不同稀释倍数）。 2．配制工作液： 根据标准品和样品数量，按试剂A:B=50:1 配制适量BCA 工作液，充分混匀（注意：BCA 1 工作液室温 24 h 内稳定）。 3．标曲制作与样品测定： 按下表比例加入96 孔蛋白测定板： 0.25 mg/mL 的标准品 1mg/mL 的标准品 终浓度 0 31.25 62.5 125 250 500 1000 试剂/编号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ BCA 标准品，μL 0 2.5 5 2.5 5 10 20 PBS ，μL 20 17.5 15 17.5 15 10 0 工作液，μL 200 200 200 200 200 200 200 样品测定： 2 μL 样品+ 18μL PBS 缓冲液+200μL 工作液 可做3 个重复）；蛋白裂解液用水按相同 的比例稀释作为样品的空白对照 37 C 孵育30 min，酶标仪OD 595 nm 测定吸光度；根据标曲和样品吸光度计算出样 品相应的蛋白浓度；将蛋白统一用蛋白裂解液稀释至合适的浓度（注意：蛋白冰上操作），- 80 C