分子生物学课件—1工具酶.ppt

连接酶(Ligase) T4 DNA ligase 68kDa，T4噬菌体感染大肠杆菌产生 催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键 底物： DNA or RNA(效率低) 粘端(matched end)、切口(nick)、平端(blunt end) 10% PEG(聚乙二醇)，单价阳离子（150-200mM NaCl）提高平端连接速率。 条件 16℃－4hr；4℃－overnight ， 需ATP E.coli DNA ligase 与T4 DNA ligase相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 参与； 平端连接效率低，不将RNA连接到DNA，不连接RNA。 Taq DNA ligase 连接dsDNA中的缺口 作用于45℃～65℃，需NAD+ T4 RNA ligase 催化ss DNA或 RNA的 5’-磷酸与 3’羟基之间形成共价连接 核酸酶 ( nuclease) BAL 31 核酸酶 来源于Alteromonas espejiana BAL31 主要活性为3’外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3’端去除单核苷酸；具有内切核酸酶活性，切除单链DNA; 依赖 Ca2+，EDTA可抑制其活性 用途：从两头缩短DNA (用于缺失突变等） Sl核酸酶 来源于米曲霉(Aspergillus oryzae) 降解单链DNA或RNA 对dsDNA，dsRNA，DNA:RNA不敏感 酶量大可完全消化双链，中等酶量可在切口(nick)或小缺口(gap)处切割双链 用途： 去掉突出的单链尾，以产生平端 打开dsDNA合成中产生的发荚环 绿豆核酸酶 来源于绿豆芽 与Sl nuclease 相似，但比Sl更温和 核糖核酸酶A 来源于牛胰，内切核酸酶； 可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端； 用途： 除去DNA样品中的RNA 除去DNA:RNA中未杂交的RNA区 DNase I 来源于牛胰，内切酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解 ds or ss DNA； Mg2+：独立作用于每条DNA链，切割位点随机； Mn2+：两条链的大致同一位置切割dsDNA，产生平端 或1-2个核苷酸突出； 用途： 切口平移(nick translation)标记，在dsDNA上随机产生切口 随机克隆，以便安插在M13 phage上测序 分析 蛋白:DNA复合物（DNA酶足迹法） 除去RNA样品中的DNA（RNase-free） RNase H 内切核酸酶，特异性水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生3’-OH和5’P末端的产物； 不降解单链核酸、dsDNA or dsRNA； 许多酶附带该活性，比如AMV反转录酶； 用途： 在cDNA克隆，合成第二键之前去除RNA。 RNase One Promega开发，基因工程酶， 27kDa，可以将RNA降解至单核苷酸，可以在任意碱基处内切磷酸二酯键。 T4多核苷酸激酶 催化ATP的 ?-磷酸基转移至DNA或 RNA的 5’末端，也具有3’磷酸酶活性； 高浓度ATP发挥最佳活性。NH4+强烈抑制剂； 用途： 用于对缺乏 5’-磷酸的 DNA进行磷酸化(phosphorylation)。以致可用于DNA连接； 交换反应：过量的ATP可使该激酶将磷酸化的5’端磷酸转移给ADP，然后DNA从[?-32p]ATP中获得放射性标记的?-磷酸而重新磷酸化。 碱性磷酸酶 种类： 牛小肠碱性磷酸酶（CIP，CIAP） 细菌碱性磷酸酶（BAP） 活性： 除去DNA or RNA 5’磷酸 用途： 防止DNA片段自身环化 标记前（5’端）除5’磷酸 1.1.7 酶切反应条件 pH：7.0-7.9 (at 25℃)，Tris-HCl，乙酸； 离子强度： NaCl，高（100mM）、中（50mM）、低（０）； Mg2+ ：10mM MgCl2 or MgAc； DTT (dithiothreitol，二硫苏糖醇) ：1mM； 100?g/ml BSA，少数需要。 每一种酶都有其最适的反应条件，请参考产品说明书！ 双酶切策略 选用都合适的缓冲液或通用缓冲液； 当缓冲液不可替代时：先低盐缓冲液再高盐缓冲液（DNA可纯化或不纯化） 注意事项 取少量酶 最后加酶、尽快操作 减少反应体积 延长反应时间 分装保存 反应温度 大多数为37℃ 一部分为50-65℃ 少数25-30℃ 反应终止 EDTA 终浓度10mM　 加热 65℃ （80℃）20min 1.1.8　星星活性(star activity) 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性(star activity)； 实际上星星活性(star activ