Experimental study on construction of tissue engineered skin with amniotic epithelial cells and amniotic mesenchymal stem cells羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤的实验研究.pdfVIP

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤的实验研究 中文摘要 中文摘要 目 的：1.从人足月胎盘羊膜中分离羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞，建立 相应培养体系，体外共培养两种细胞探究两者二维共培养中的相互影响关系。2. 分析鉴定羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSC ）和 羊膜上皮细胞(human amnion epithelial cells, hAEC)的干细胞特性以及羊膜上皮细 胞作为组织工程皮肤表层种子细胞与人皮肤角质形成细胞的相似性。3.通过三维气 液培养以羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤。 方 法：取人足月剖宫产胎儿胎盘机械剖离羊膜，通过胰酶、胶原酶分步消化 分离培养人羊膜间充质干细胞（hAMSC ）、羊膜上皮细胞（hAEC) ，通过流式细胞 分析术鉴定两种细胞 CD90 等表型情况，通过 RT-PCR 检测基因 CMYC 等的表达 情况以鉴定 hAMSC 与 hAEC 在基因表达水平的干细胞特性，同时 RT-PCR 检测 hAEC 、hKRT19 等基因的表达，免疫荧光染色检测 hAEC K14 的表达情况以鉴定 其与人皮肤角质形成细胞的相似性同时说明其作为组织工程皮肤种子细胞的可行 性。将两种细胞按一定比例进行二维混合培养，绘制细胞生长曲线，研究两者二 维共培养中的相互影响关系。最后以鼠 I 型胶原为基质用两种细胞气液三维培养构 建组织工程皮肤，HE 染色切片观察。 结 果：（1）成功分离培养了 hAMSC 和 hAEC ，体外共培养实验中 hAEC 生 长状态良好具有较快的增殖速度，表型无明显改变；（2 ）流式细胞术检测体外培 养 hAMSC 和 hAEC 均高表达 CD90、CD73、CD105，不表达造血干细胞标志 CD34 以及MHC-II 类分子 HLA-DR 。RT-PCR 检测到 hAMSC 表达干细胞特性基因 CMCY 和 NANOG ，hAEC 表达干细胞特性基因 CMCY 和 KLF4 ，RT-PCR 检测 hAMSC 表 达皮肤角质形成细胞特性基因 K19 、β1-integrin、K8 ，hAEC 表达 K19 、β1-integrin、 K5 、K8 ，免疫荧光染色见hAEC 表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白 K14 ； (3)通过气液培养利用两种细胞成功构建组织工程皮肤，HE 染色切片显示其具有一 定的皮肤结构，且 hAEC 发生了初步分化。 结 论：hAMSC 与hAEC 均有一定的干细胞特性，hAEC 与皮肤角质形成细胞 更具相似性，在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。共培养结果显示在 I 中文摘要 羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤的实验研究 三维工程皮肤的培养中生长于基质部分的hAMSC 对表层的hAEC 可以起到一定的 滋养作用。本研究通过气液培养成功构建了组织工程皮肤，证实了 hAMSC 与hAEC 通过三维培养构建人工皮肤组织是可行的。 关键词：组织工程皮肤；羊膜间充质干细胞；羊膜上皮细胞；共培养；分化 作 者：徐 彪 指导教师：陈永珍 II 羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤的实验研究 英文摘要 Experimental research on tissue engineering skin construction with human amniotic epithelial cells and amniotic mesenchymal stem cells A