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一株生产有机硒菌的筛选鉴定及有机硒转化能力测定 　　摘要：从烟草废弃物中分离出一株能大量生产有机硒的微生物菌株。采用细菌分离筛选方法选育出单菌种，用无机硒配制发酵液，进行有机硒转化效果试验。用光学显微镜观察菌种形态特征，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行一系列生理化学反应观察其生理生化特征。应用基因测序技术，确定物种归属。结果表明，该菌为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）种的新菌株。该菌可将700 mg/L亚硒酸钠全部转化为水溶性有机硒，用于水稻根外喷施，水稻对该发酵液发酵生产的有机硒利用率最高达64.12%，稻米中总硒含量最高达0.432 mg/kg，有机硒占总硒的比例最高达84.9%。 　　?P键词：富有机硒菌；菌种鉴定；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 　　中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6389-06 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.018 　　硒是人体必需的微量元素之一，必须通过饮食获取，硒广泛分布于机体的各组织器官、体液中，在肾中浓度最高。硒在人体内总量为14～20 mg，具有抗氧化作用（抗辐射、抗炎、抗衰老）、提高免疫功能（抗病毒）、抗癌、维持甲状腺正常功能、促进生殖作用、拮抗重金属、抗糖尿病、抗高血压、保护肝脏、参与蛋白质和酶及辅酶的合成等功效，可预防克山病、大骨节病、心血管病、癌症、糖尿病等40多种疾病[1-5]，与人体健康息息相关，。 　　由于硒不能在人体长期储存，面对人体内硒的不断流失和摄入不足，机体必须不断从饮食中获得足量的硒，才能维持硒在身体内的平衡。硒浓度的平衡对许多器官、组织的生理功能有着重要的保护和促进作用。目前许多对疾病的化学干预试验已证明硒蛋白在一些重大疾病防治中具有重要作用[6]。 　　全世界有40多个国家和地区属于缺硒地区。中国存在一条从东北三省斜穿至云贵高原的低硒带，导致占国土面积72%的地区属低硒地区，其中缺硒区占43%，严重缺硒地区占29%，粮食等天然食物硒含量较低，通过使用这些食物不能满足人体对硒的需求[7]。中国近2/3的人缺硒或处于缺硒边缘[8]。中国营养学会推荐硒的日摄入量不能低于60 μg，正常成人日摄入硒的安全和合适范围为60～250 μg，且膳食硒日最高安全摄入量为400 μg[9-11]。 　　自然界中存在的硒元素分为无机硒和有机硒两种。无机硒一般指亚硒酸钠和硒酸钠等；有机硒是通过生物转化使硒与生物体内有机物质结合而成，一般以硒蛋白、硒氨基酸、硒多糖、硒核酸[12-14]等形式存在。二者都可以被动物吸收利用，但与无机硒相比，有机硒具有使用较安全、吸收利用率高、营养价值高等优点。微生物富硒发酵是利用生物资源对硒开发的一项重要课题，具有广阔的前景。硒多糖、硒蛋白、硒核酸都是易于被动植物吸收的优良补硒剂，具有良好的药理及保健作用。 　　目前有机硒的获得包括微生物转化法、植物转化法和动物转化法等[15]，微生物转化法中较多的是利用酵母[16]和乳酸菌[17]。在富硒区，仅仅依靠土壤中的硒很难使农产品的硒含量达到标准，必须依靠外源补硒，即通过生物转化来获得有机硒含量较高的农产品，但目前生产上多用亚硒酸钠根外喷施来获得富硒农产品，硒的利用率不高，且转化为有机硒的效率不高，使富硒农产品中有机硒的含量很低。因此，本研究致力于通过微生物提高有机硒转化率，进而为提高农产品中有机硒含量提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 仪器与设备 智能发酵罐（镇江东方生物工程设备技术公司）、超净工作台（苏州隆意达净化科技有限公司）、恒温摇床（武汉科学仪器厂）、试管、培养皿、接种环、酒精灯、250和500 mL三角瓶、光学显微镜。 　　1.1.2 菌种 分离得到具有高无机硒转化为有机硒能力的Ⅲ号菌种。 　　1.1.3 培养基 葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂15～20 g、NaCl 5 g、去离子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；明胶培养基：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、明胶120 g，加去离子水至1 000 mL，调节pH 7.2～7.4；糖代谢检测培养基：（NH4）2HPO4 1.0 g、KCl 0.2 g、MgSO4?7H2O 0.2 g、酵母膏0.2 g、琼脂15 g、溴甲酚紫0.008 g、葡萄糖5 g（可用核糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇代替），加去离子水1 000 mL。 　　1.2 方法 　　1.2.1 菌种的分离筛选 采样与样品处理：采集湖北恩施市白杨坪的富硒烟草废弃物，称取1 g样品置于盛有99 mL无菌水的三角瓶中，