漆斑菌属胆红素氧化酶的纯化、分析及基因克隆.pdfVIP

摘要 摘 要 胆红素氧化酶 BOD是一种催化胆红素生成胆绿素和其它物质的一种酶 一些胆红素氧化酶已从疣孢漆斑菌和微紫青霉等生物体中被分离纯化出来 本研究对漆斑菌属的疣孢漆斑菌和三种露湿漆斑菌进行培养 培养过程 4 中发现 加入 2610 的诱导剂 CuSO可很大程度地提高这四种菌BOD的 4 活性 我们从漆斑菌属的四种菌中分离纯化出了胆红素氧化酶 纯化过程中阳离 子交换树脂代替活性碳 低温 甘油都有助于酶活的保持 与疣孢漆斑菌BOD相比较 露湿漆斑菌3.1967BOD的分子量 胆红素-聚丙 烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳条带 糖染结果 等电点 纯化条件等都 不相同 这说明露湿漆斑菌 3.1967BOD是不同于疣孢漆斑菌BOD的一种酶 在 BOD的鉴定过程中胆红素平板 胆红素-聚丙烯酰胺凝胶电泳 糖染与银染结合 法是未被报导过的新方法 这些方法的应用对于BOD的鉴定很有帮助 本实验对BOD的测定方法也有所改进 以露湿漆斑菌 3.1967BOD各种性质 作根据 在酶的最适反应条件下 37 pH8.1进行反应 胆红素有最大吸收 峰的波长440nm下测定OD值 以抗坏血酸和EDTA作为反应终止剂将反应终止在 特定的时间 使酶活测定不用恒温分光光度计 而只用普通的分光光度计就可测 定 这也将有助于胆红素酶法测定的推广和应用 根据Genebank中疣孢漆斑菌胆红素氧化酶(MV BOD)基因的编码序列设计引 物 利用PCR从疣孢漆斑菌的染色体DNA中扩增得到1937bp的基因 将其克隆 到T载体中 构建成重组质粒 并对其测序 通过测序验证了本实验所合成引物 的正确性 为下一步的基因工程操作打下了基础 关键词 胆红素氧化酶 漆斑菌 胆红素平板 胆红素-聚丙烯酰胺凝胶电泳 糖 染与银染结合染色法 i Abstract Abstract Bilirubin oxidases BODare enzymes Some kinds of bilirubin oxidaseshavebeenpurified fromMyrotheciumuerrucuriaandPeniciilium janthinellum. In this study, we culturedMyrothecium verrucaria ofMyrothecium roridum 4 10 CuSO into 4 lowtemperatureglycerin activity. Comparing with BOD fromMyrothecium verrucaria(MV BOD),BOD from Myrothecium roridum(MR BOD) the result ofelectrophoresis ondition of Myrotheciumroridumis a new type of BOD which is different fromMV BOD. bilirubin, BilirubinandDouble Staining of are new methods thatwill be used inidentification ofBOD activities. The ordinary methods of measuring theBODs amin C and EDTA out. theGenebank,