改良CTAB法提取草莓基因组DNA.pdfVIP

2014年第6期 现代园艺 改良CTAB法提取草莓基因组DNA 张璐璐 -，樊 晨 ，樊哲 ，高庆玉 (1西安职业技术学院生物工程系 ，陕西西安 710077；2东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨 150030) 摘 要：草莓中多糖多酚含量丰富，同DNA结合生成凝胶状物，使其无法用于后期研究，恰当的草莓DNA提取方法一直未能找 到。在前人工作基础上，改进了提取植物DNA的CTAB法，得到的草莓基因组DNA纯度较高，可用于后期实验所需。 关熊词：草莓；基因组DNA；改良CTAB法；PCK 草莓是一种多年生草本植物，属于蔷薇科草莓属， 醇、异丙醇、70％乙醇、无水乙醇、醋酸钠、氯化钠、盐 是世界上温带地区的一种重要水果 ，它营养丰富，产量 酸、氢氧化钠 、冰乙酸、硼酸均购 自大连宝(TaKaRa)生 高，用途广泛，具有重要经济价值。草莓富含多糖多酚， 物工程公司，琼脂糖 、10×LoadingBuffer、DL2000DNA 多酚是一种很强的氧化因子并能够不可逆地 同DNA Marker均为Takara公司产品。 结合，生成褐色的凝胶状物 ；高水平的多糖也可以使 仪器设备：电子天平、微波炉、冰箱、蒸馏水器、研 DNA形成粘性沉淀而难以处理l【】。这些化合物在高浓 钵和研杵、烧杯、电热恒温水浴锅、核酸电泳槽、稳压稳 度时，还会抑制限制性内切酶和DNA聚合酶，使得提 流电泳仪、紫外可见分光光度计、紫外切胶仪、高压蒸 取的DNA无法用于包括 AFLP、RAPD分析 ，PCR和基 汽灭菌锅、离心管、Eppendorf移液枪、吸头。 因克隆等研究中。对于许多植物来说，用简单的碱裂解 2 试验方法 法就可以制备得到足够量的用于扩增的叶片 DNA，而 2．1DNA的提取采用2种方法分别进行 恰当地提取草莓DNA的方法一直未能找到，因此解决 2．1．1采用原始 CTAB法翻(小量提取)：a．取 10—100mg 这一问题对后期检测工作显得尤为重要。因此，本课题 的叶片，于液氮中研磨成粉．b．将冻粉转入预冷的离心 组在前人工作基础上，对草莓基因组 DNA的提取方法 管中，立即加入 0．7ml(w／v)65oC预热的2XCTAB提取 进行了优化和对比分析，以期为以后的工作奠定基础。 缓冲液，充分混匀，65℃保温30～40min，其间不时摇 1 试验材料 动；c．加入等体积的氯仿 ，异戊醇(24：1)，轻缓颠倒离 试验选用黑龙江省草莓主栽品种森嘎拉和戈雷拉 心管混匀 ，室温下 12000rpm离心 10min；d．将上清液 作为试验材料，材料来源于东北农业大学园艺试验站 转入另一个离心管中，加入 1／10体积的10％CTAB混 果园。 匀 ，加入等体积的氯仿 ，异戊醇，颠倒离心管混匀 ，室 液氮、CTAB、Tris、EDTA、2一巯基乙醇、氯仿、异戊 温下 12000rpm离心 10min；e．重复操作 1次 ；￡将上清 2．7加标 回收率 实验 本文建立了苹果、青椒、西红柿和茄子中绿原酸的 分别准确取 4份茄子各 15g，各加入 80％乙醇溶 HPLC测定方法 ，采用乙腈和磷酸缓冲液(0．5％)进行洗 液 20mL，分别在组织匀浆机中捣碎匀浆后置 50mL容 脱 ，绿原酸在 12min内得到了很好的分离 ，采用 330nm 量瓶中，在其中的3份中分别加入不同量的绿原酸标 波长进行检测，使绿原酸有较强吸收，从而降低了检测 准溶液，加80％乙醇溶液至刻度，摇匀，超声20min，过 限。定量分析结果表明，该方法精密度好、回收率高。 滤 ，取滤液，用微孔滤膜(0．45 rfi)过滤 ，取其滤液，作 (收稿：2014