核酸凝胶电与泳.pptVIP

核酸凝胶电泳 引言： 核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定DNA在凝胶中的位置。 影响核酸电泳的因素： 1．核酸的性质 2．凝胶孔径的大小 3．电场强度和电场方向 4．电泳环境 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 核酸电泳的指示剂 ： 核酸电泳常用的指示剂有两种： ⑴溴酚蓝 ⑵二甲苯青， DNA的琼脂糖凝胶电泳 引言：琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对DNA电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10～500 bP）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。 【实验目的】 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和操作方法。 【实验原理】 DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254～365 nm紫外光照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA（此法可观察到凝胶中2 ng的DNA）。如有必要可从凝胶回收DNA片段，用于分子克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约200 bp～50 kb。 【实验材料】 1．电泳仪。 2．电泳槽。 3．紫外透射仪。 4．试剂 【实验方法】 1．琼脂糖凝胶板的制备 将1～2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到60～70℃加EB至浓度0.5 μg/ml，倒入封好的凝胶槽，厚度约3～5 mm，在距底板0.5～1 mm的位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，可用吸管小心吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1～2 mm为止。 2．加样 样品中加1/5体积的上样缓冲液，混匀，取10～15 μl加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的DNA相对分子质量标准物。 3．电泳 电压＜10 V/cm，电泳至溴酚蓝移出样品槽到凝胶板的2/3距离时，关闭电源。 4．取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色DNA区带。 【实验思考】 1．影响DNA片段琼脂糖电泳有哪几个因素？操作DNA琼脂糖凝胶电泳时为何要戴手套？ 2．DNA片段琼脂糖电泳操作应注意哪些问题？ * * *