酶学DNA分子胗克隆过程.pptVIP

表达载体：含特殊的DNA调节序列，核糖体结合位点和表达表达标签等 1，真核生物细胞表达载体。 （1）不带标签的表达载体 （2）带标签的表达载体 2，原核表达载体 表达载体的修饰 1，分泌型表达载体 2，可调节型表达载体 在原核生物中表达真核生物基因应该注意的问题 1，基因的基因组DNA不能在原核生物中进行表达，因为原核生物不能进行RNA加工 2，如果蛋白质的生物学活性依赖于蛋白质的修饰，比如：糖基化等，不适于在原核生物中表达，因为原核生物不能进行翻译后加工 3，真核生物基因的毒性作用 第三种方法 四，特异基因SiRNA的体外制备 ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ ～ RNaseIII 五，micro-RNA的克隆 OH P Poly(A)聚合酶 dATP P AAAAAA T4 RNA ligase OH RNA AAAAAA 逆转录酶 AAAAAA TTTTTT TTTTTT cDNA PCR和克隆 上游引物 下游引物 六，DNA调节序列缺失体的构建 七，点突变 八，基因表达分析 NASBA （Nucleic Acid Sequence-Based Amplification ） 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ RT 3’ 5’ Primer 2 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Primer 1 Primer 2 RT RT RNase H Cyclic Phase T7 RNA Polymerase 5’ 3’ Primer 1 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ RT 3’ 5’ RNase H 载体 质粒 噬菌体 病毒 质粒：作为载体的质粒一般具有以下特点： 分子相对较小，3~10 kb左右； 具有松弛型复制子； 在复制子以外适当的位置，存在几个单一内切酶位点， 便于外源DNA 片段的插入； 具有抗药性和 / 或插入失活的筛选标记。 * 酶切 连接 二。DNA克隆的过程 导入宿主细胞 筛选 扩增 三。工具酶。 1。限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease）: 识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割DNA双链 结构的一类内切酶。 根据酶的结构，所需要辅助因子及裂解DNA的方式不同，分为三类。 I 类：由三种不同的亚基组成，需要Mg++, SAM和ATP为辅助因子， 这类酶识别部位复杂，特异性差。 II 类：由三种亚基组成，需要Mg++，ATP为辅助因子。 III 类：由一种亚基组成，其活性仅需要Mg++作为辅助因子， DNA切割就发生在特异识别的部位范围内。 根据识别部位核苷酸组成的特点，可将识别部位分为四种类型。 （1）回文结构：比如： EcoRI 5‘- G AATTC –3’ 3‘- CTTAA G –5’ KpnI 5‘- GGTAC C –3’ 3’- C CATGG –5’ MspI 5‘- CC GG –3’ 3’- GG CC – 5’ (2) 间断回文结构: Bgl I 5‘- GCCNNNN NGGC –3’ 3’- CGGN NNNNCCG –5’ （3） 简并序列 Ava II 5‘-G GA/TCC-3’ 3’-CCT/AG G-5’ (4) 非回文序列 Mbo II 5‘-GAAGAN8 –3’ 3’-CTTCTN7 -5’ 同识异切酶，比如 Hpa II, MspI CCGG – -GGCC - 所切割的DNA具有相同的粘性末端的一类酶：比如，SalI和XhoI SalI 5‘- G TCGAC –3’ 3’– CAGCT G – 5’ Xho I 5‘- C TCGAG –3’ 3’- G AGCT C –5’ 二。修饰酶 1。DNA聚合酶I：活性包括 5‘?3’ DNA聚合作用 (2) 3‘?5’外切酶活性 (3) 5‘?3’外切酶活性 Klenow片段：DNA聚合酶I C 端的大片段， 活性包括 (1) 5‘?3’ DNA聚合作用 (2) 3‘?5’外切酶活性 用途： 标记DNA的3‘末端 修饰突出的3‘或5’末端以产生平端 随机寡核苷酸引物介导的DNA标记 克隆cDNA时合成第二链 双脱氧法DNA测序 2。T4 DNA聚合酶： 活性： DNA聚合酶活性 3‘?5’端外切酶活性 （单链或双链） 缺少5‘?3’端外切酶活性 放射性标记DNA片段的3‘末端 选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3‘末端， 即所谓的“ 置换合成” (3) 变双链DNA的粘性末端成平端 用途： 3。T7 DNA聚合酶 （