定位候选克隆技术从疾病到基因.PDF

定位候选克隆技术：从疾病到基因 如何将疾病这种表型与基因关联起来呢？1986 年剑桥大学的Alan Coulson 首先提出了定位克隆 (position cloning)的概念。根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，利用连锁分析将基因定 位到染色体的某个具体位置，再通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记， 不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和疾病的生化机理。不过，定位克隆也存在一定的 局限：需要构建跨叠克隆群和精细遗传图谱，耗费大量的人力、物力和时间。因此，人们也试图不断 改进它。 定位候选克隆 (positional candidate cloning ） 法筛选致病基因(包括肿瘤易感基因)的基因组杂合 就是定位克隆的一种改进方法，被认为是目前最有 性丢失(loss of heterozygosity, LOH)的高频率区， 发展前途的基因定位策略。它克服了经典的定位克 从而对致病基因进行定位候选克隆。 隆纯粹依靠连锁分析进行染色体定位的繁琐而缓 所谓杂合性缺失即染色体某一基因座上的等 慢的弊端，大大加快了克隆工作的进程，而且它也 位基因之一出现缺失或突变，使同源染色体相同位 不仅仅局限于遗传病，现在已更多地运用于肿瘤易 置上的基因呈杂合状态。杂合性缺失是肿瘤细胞中 感基因的克隆。 一种常见的染色体变异，往往丢失的片段中包含着 此法是将图谱的一系列标记与连锁分析相结 与肿瘤相关的基因。其中，抑癌基因杂合缺失是导 合，把与遗传病有关的基因定位到图谱的某一区 致肿瘤产生的一个主要因素，通常在杂合性缺失的 域，然后，利用已有数据查找到定位于此区域的所 高频区域含有一个或多个抑癌基因，利用图谱上的 有已克隆的基因或cDNA，快速筛选染色体上与致 各种标记(如 STS、MS 等)，通过PCR 等方法检 病基因相关的可能位置，从中克隆出相关的致病基 测肿瘤样本中染色体的杂合缺失情况，杂合性缺失 因，再对这些编码的蛋白质进行功能分析并与相应 的高频区域即是基因的候选位置，通过指示标记定 的疗程及症状做比较，找到最可能的候选致病基 位疾病基因。荧光原位杂交(FISH)可对染色体的易 因，对患者的染色体进行细胞学检查，利用突变基 位缺失等变异进行高灵敏度检测。 因动物模型与疾病的一致性，最终确定该候选基因 2、致病基因的候选cDNA 筛选 是否是致病基因。 在致病基因被介定于狭窄的DNA 重叠克隆区 定位候选克隆包括三个基本步骤：染色体区域 域的基础上，对该区域中的基因位点进行测序，将 定位、候选cDNA(或EST)获得、全长cDNA 及基 变异位点的核苷酸序列与正常序列进行比较，可确 因结构功能分析和鉴定。 定致病基因的位置。随着区域性 基因图谱的构建 1、染色体区域定位 和标记位点的增多，从相互重叠的克隆群中筛选候 选 cDNA 即筛选致病基因的表达序列和基因定位 定位候选克隆的基因区域定位多采用 PCR 的步伐会大大加快。目前cDNA 筛选策略主要有以 法、FISH 技术、染色体显微切割和辐射图谱等方