《酶动力学及抑制剂》第2讲酶的抑制作用（续）.ppt

2003年邹承鲁院士在我校讲座 讲座中的邹先生风采 最后一次特邀聚课外练习 AμM C μM 1.9 2.85 4.75 7.6 11.4 0 9.4 12.0 16.8 20.2 24.8 0.91 7.7 9.2 14.0 18.2 21.6 1.82 6.2 8.2 12.0 16.0 19.2 3.64 4.9 6.8 9.2 13.2 17.6 A是某酶底物，C是抑制剂。反应的摩尔消光系数变化为 6.02 x 103 ⊿O.D/(mol/L).cm ，测活体积2ml，光径1cm。请作图并计算： 1) 无抑制时Km(?M) 和Vm (nmol/min); 2) 讨论A和C的竞争关系； 3) C的抑制常数(?M). 反应速度数据（×10-3 ⊿O.D/min）： 本次课结束 下次课再见！ Thank you！ 酶动力学及抑制剂 Enzyme kinetics and Inhibitors 第二讲 酶的抑制作用动力学 （续） 四. 酶的不可逆抑制动力学 1. 一级反应动力学 半对数作图 2. 二级反应动力学 如果抑制剂浓度与酶浓度差别不大，必须以二级反应来处理，产物公式为： 实验测定多个时刻的R.A.，由 [P]=[Eo] (1-R.A.) 计算[P]，根据上式以ln（[Io]-[P]/[Eo]-[P])对时间作图可得直线，斜率为k2（[Io]-[Eo]）,可计算得到k2 的值。 二级反应的半对数作图 速度常数的单位： 半对数作图斜率的量纲为 (时间)-1。一级速度常数单位与斜率相同，一般为min-1或 sec-1; 二级速度常数单位为斜率/浓度，如 (min. mmol/L)-1。 实验设计和作图 1）配制酶溶液并测定活性，记为A0。 2）抑制剂加到酶溶液中，立即混匀并开始计时。 3）在设定的一系列时间间隔取样测定酶活性，记为At；时间按失活快慢设定，开始间隔小，后期间隔大，总数不少于3个，越多总体偶然误差越小。 RA= At/A0。 4）以Ln RA对time作图，直线斜率的相反数为失活的一级速度常数。如果抑制剂和酶浓度接近则由RA和酶浓度计算[P]，再以[Io]-[P]/[Eo]-[P]的对数对时间作图，斜率除[Io]-[Eo]得失活反应的二级速度常数。 5）如作图后期斜率减小，取前面的直线部分。 操作及作图注意点 1）A0测定和At测定的实际加酶量要一致。 2）失活速度和温度密切相关，酶和抑制剂混合后需在设定温度下保温。 3）直接用半对数作图需抑制剂浓度大大高于酶浓度，至少要在10倍以上（1：1作用时）。否则需用二级反应产物方程作图和计算失活的二级速度常数。 4）作图的起始部分如速度快速下降而后部下降斜率变小，可根据情况用二相处理或忽略后部。 五、亲和标记 (Affinity Labeling） 亲和标记，是最有意义的一种不可逆失活，这是因为它可以很专一性地作用于酶的活性部位。亲和标记是分步反应，修饰剂先可逆地结合在酶的活性部位，再不可逆地修饰该部位必需基团，而造成不可逆失活。亲和标记修饰剂一般是底物类似物，和底物含有共同的结合于酶的基团。亲和标记的作用符合饱和动力学特征。可以把亲和标记过程看做一次自杀性酶反应。 典型实例：TPCK专一作用胰凝乳蛋白酶 胰凝乳蛋白酶合成底物 专一性抑制剂TPCK 亲和标记的动力学特征 亲和标记作用过程： 一般化学修饰反应速度和修饰剂浓度成正比。但亲和标记反应速度：V = k [EI], 不和修饰剂浓度成正比，而是表现为饱和动力学特征，最大反应速度为全部酶成为复合物时的速度，即Vm= k [E0]。 按和推导米氏公式类似方法可得到： 式中Vm和V分别为[I]饱和和不饱和 时的失活速度。Ks为可逆结合步骤 的解离常数。 亲和标记反应速度方程 由于 Vm = k[E0]， V = k [EI] = kobs[E0] ， 由上式可得到 : 式中k为修饰步骤的真实速度常数，kobs为测定的速度常数。此速度常数为一级速度常数。亲和标记反应不符合二级反应动力学，没有二级速度常数。 此式作图为双曲线，双倒数作图为直线。 对比酶反应动力学（米氏公式）。 实验判断 检测kobs和抑制剂浓度关系的动力学方法是最广泛易行的亲和标记实验判断方法。 实验设计： 选择若干修饰剂浓度，在可测定的条件下浓度差距越大越好。对每个浓度作失活过程实验，半对数作图得到速度常数测定值。以kobs对修饰剂浓度作图，为过原点直线的是简单二级反应，为双曲线（双倒数作图为直线）的是亲和标记。 作图、计算 双倒数公式： 1/kobs = 1/k + Ks/k (1/[I]